THOC1基因生物學(xué)功能及其相關(guān)機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　研究THOC1基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞的生長增殖、侵潤、轉(zhuǎn)移和放射敏感性影響及其相關(guān)作用機(jī)制,為THOC1基因?qū)碜鳛槟[瘤治療的一個新的靶基因應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將pcDNA3-THOC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞SPC-A-1和NCI-H1975中,將U6/GFP-shTHOC1的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到肺癌細(xì)胞95D中,通過G418篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)株,采用qPC

2、R和Western Blot法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中THOC1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　2、通過MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布和凋亡;細(xì)胞劃痕實驗觀察細(xì)胞體外遷移能力;Transwell侵襲實驗檢測細(xì)胞體外侵襲能力;Western blot方法檢測細(xì)胞增殖、周期調(diào)控蛋白、凋亡、侵潤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　3、將SPC-A-1、SPC-A-1/Neo、SPC-A-1/THOC1細(xì)胞懸液接種于皮下,建

3、立BALB/c肺癌腫瘤模型。觀察 THOC1對體內(nèi)腫瘤生長增殖的影響;觀察 THOC1對裸鼠體重、主要臟器臟器指數(shù)和血清中主要血生化指標(biāo)的影響;通過HE染色觀察腫瘤及主要臟器的病理變化,免疫熒光實驗分析THOC1、Ki-67以及VEGF的表達(dá)情況。
　　4、X射線照射后,通過克隆形成實驗檢測肺癌細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù),流式細(xì)胞儀檢測肺癌細(xì)胞周期分布、凋亡和ROS;彗星實驗檢測DNA損傷和修復(fù)情況;免疫熒光法檢測g-H2AX的變化;West

4、ern blot方法檢測細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、DNA損傷修復(fù)、參與DSB的非同源末端連接修復(fù)途徑的相關(guān)蛋白的表達(dá)變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建穩(wěn)定、高表達(dá)THOC1基因的肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1/THOC1和NCI-H1975/THOC1兩種細(xì)胞株,檢測到THOC1基因的mRNA水平和蛋白水平呈高表達(dá);構(gòu)建了穩(wěn)定的干擾THOC1基因的95D/shTHOC1細(xì)胞株,檢測到THOC1基因的mRNA水平和蛋白

5、表達(dá)水平較對照組和空白組低。
　　2、與對照組和空白組細(xì)胞相比,SPC-A-1/THOC1和NCI-H1975/THOC1的生長速度減慢,細(xì)胞增殖能力降低;95D/shTHOC1的生長速度較快,細(xì)胞增殖能力升高;SPC-A-1/THOC1細(xì)胞中p-Akt、p-GSK-3β、p-JNK的蛋白表達(dá)水平降低,p-c-Raf、p-PDK1和p-P38的蛋白水平上升;NCI-H1975/THOC1細(xì)胞中p-GSK-3β、p-JNK蛋白表達(dá)水

6、平下降,p-PDK1、p-P38、p-Erk1/2的蛋白表達(dá)水平上升;而95D/shTHOC1細(xì)胞 p-GSK-3β蛋白表達(dá)水平上升,p-P38蛋白表達(dá)水平降低。SPC-A-1/THOC1和NCI-H1975/THOC1細(xì)胞周期的G2/M期的細(xì)胞比例增高,CyclinA和CyclinB1蛋白表達(dá)水平上升;95D/shTHOC1細(xì)胞周期的G0/G1期細(xì)胞比例升高,CyclinD1蛋白表達(dá)水平下降,CyclinE1蛋白表達(dá)水平上升。

7、　　3、與對照組和空白組細(xì)胞相比,SPC-A-1/THOC1和NCI-H1975/THOC1組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)水平升高。
　　4、與對照組和空白組細(xì)胞相比,THOC1的高表達(dá)明顯降低SPC-A-1的體外侵襲轉(zhuǎn)移能力,SPC-A-1/THOC1組劃痕實驗的間隙較寬,Transwell侵襲實驗穿過基質(zhì)膠膜到達(dá)下層的細(xì)胞明顯減少。SPC-A-1/THOC1組細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、基質(zhì)金屬蛋白酶M

8、MP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平均低于對照組細(xì)胞。
　　5、與未轉(zhuǎn)染基因的母細(xì)胞和“空”質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種的裸鼠的腫瘤相比,THOC1基因高表達(dá)的肺癌細(xì)胞接種的裸鼠腫瘤生長率明顯下降;平均瘤重和平均瘤體積均降低;但對接種的裸鼠體重及主要臟器的臟器指數(shù)沒有明顯影響;對AST、ALT、CREA、UREA、ALP、ALB等血生化指標(biāo)和主要臟器形態(tài)學(xué)沒有明顯影響;通過免疫熒光,觀察到THOC1基因的高表達(dá),明顯降低Ki-67和VEGF的表達(dá)

9、。
　　6、與各對照組細(xì)胞相比,THOC1高表達(dá)使肺腺癌細(xì)胞射線照射后的克隆形成率明顯降低;轉(zhuǎn)染THOC1基因的肺腺癌細(xì)胞受照后均出現(xiàn)G2/M期阻滯,CyclinB1蛋白表達(dá)水平上升,CyclinD1的蛋白表達(dá)水平下降。THOC1基因高表達(dá),使肺腺癌細(xì)胞受照后的細(xì)胞凋亡率和ROS增高;p-Akt的蛋白表達(dá)水平降低,p-P38、p-Erk1/2的蛋白表達(dá)水平升高。
　　7、與各對照組細(xì)胞相比,THOC1高表達(dá)的SPC-A-1/

10、THOC1細(xì)胞受照后彗星尾長未見明顯增長,尾部DNA含量的比例也未見明顯增多;γ-H2AX位點(diǎn)數(shù)與熒光強(qiáng)度未見明顯升高。DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白Ku-70、Ku-80、DNA-PKcs、XRCC4、Rad50、Mre11水平未見明顯改變。
　　結(jié)論:
　　1、成功獲得穩(wěn)定、高表達(dá)THOC1基因的肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1/THOC1和NCI-H1975/THOC1兩種細(xì)胞株和穩(wěn)定的干擾THOC1基因的95D/shTHOC1細(xì)胞

11、株。
　　2、THOC1高表達(dá)能明顯抑制肺癌細(xì)胞生長增殖、促進(jìn)凋亡,干擾THOC1基因后能夠促進(jìn)細(xì)胞生長、增殖,其可能的機(jī)制包括THOC1參與細(xì)胞周期調(diào)控、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及通過PI3K-Akt和MAPK信號通路發(fā)揮相關(guān)作用。
　　3、THOC1高表達(dá)抑制肺腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,其可能的機(jī)制與下調(diào)NF-kB、MMP-9、MMP-2的表達(dá)相關(guān)。
　　4、THOC1高表達(dá)能提高肺腺癌細(xì)胞的放射敏感性,其可能的機(jī)制與THOC