Wnt2b對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)功能的影響及相關(guān)機(jī)制探究.pdf

1、研究目的
　　肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一，也是威脅人類(lèi)健康的重大疾病，其發(fā)病率一直很高。在我國(guó)，肝癌的死亡率位列第二、發(fā)病率位列第四。對(duì)于肝癌的診斷，主要是對(duì)腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)和影像學(xué)檢查。對(duì)于肝癌的治療的方法有很多，例如手術(shù)切除等。但是，盡管經(jīng)過(guò)了有效的治療，肝癌仍然有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能。因此，需要進(jìn)一步闡明肝癌發(fā)生的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)肝癌發(fā)生時(shí)有差異的分子和異常的信號(hào)通路，尋找有效治療肝癌的新方法，為臨床治療提供新的方向。

2、　　近年來(lái)的研究中有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有異常活化的信號(hào)通路。值得我們重視的是，在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有Wnt經(jīng)典信號(hào)通路的活化現(xiàn)象。Wnt信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路，其在生物體的胚胎發(fā)育，組織修復(fù)與再生，調(diào)控生物體內(nèi)與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、自我更新和生存基因的表達(dá)發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)所激活信號(hào)通路的不同，Wnt信號(hào)通路若依賴于β-catenin分子發(fā)揮作用則為經(jīng)典的信號(hào)通路;若不依賴，則為非經(jīng)典通路。
　　關(guān)于Wnt

3、與肝臟的研究主要集中于Wnt信號(hào)通路在肝纖維化過(guò)程中發(fā)揮的作用。研究表明，當(dāng)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路發(fā)生活化時(shí)可激活肝星狀細(xì)胞而導(dǎo)致肝纖維化。但是，對(duì)于Wnt信號(hào)通路與肝癌的研究比較少，且目前對(duì)于Wnt家族分子的研究主要集中于Wnt3a與Wnt5a。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織相比，病變肝臟中Wnt2b分子呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)，并且與疾病嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。在TLR4促進(jìn)HCC發(fā)生、TLR2抑制HCC發(fā)生的前提下，我們發(fā)現(xiàn)TLR4激動(dòng)劑刺

4、激人肝癌細(xì)胞系(HepG2，H7702)和鼠肝癌細(xì)胞系(Hepa1-6) Wnt2b表達(dá)上調(diào)，TLR2激動(dòng)劑刺激則表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果提示我們，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，Wnt2b可能起到關(guān)鍵的作用。根據(jù)上述的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中利用分子生物學(xué)手段，探討了Wnt2b分子對(duì)肝癌細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)特征的影響，并探討相關(guān)機(jī)制;并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，Wnt2b促進(jìn)小鼠腫瘤的生長(zhǎng)，且抑制腫瘤組織中NK細(xì)胞的數(shù)量和比例。另外，本研究初步探討了抑制W

5、nt2b的表達(dá)輔助治療肝癌的應(yīng)用，為肝癌的治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法
　　1.以幾種常見(jiàn)的人和鼠肝癌細(xì)胞系為模型，采用MTT法、細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TLR2激動(dòng)劑Pam3CSK4和TLR4激動(dòng)劑LPS對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　2.采用免疫熒光、免疫組化及western blot方法，檢測(cè)TLR4對(duì)肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中β-catenin的影響。
　　3.以不同的TLR缺失小鼠為模型，采用半定

6、量RT-PCR法檢測(cè)Wnts mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平。采用半定量RT-PCR法，檢測(cè)TLR2和TLR4對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2所有Wnts mRNA水平的影響。
　　4.采用半定量RT-PCR法和western blot，檢測(cè)TLR2和TLR4對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、H7402和鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6中Wnt2b mRNA的影響。
　　5.采用MTT法檢測(cè)Wnt2b對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。采用細(xì)胞集落形成方法和Real-ti

7、me PCR探究Wnt2b對(duì)肝癌細(xì)胞系干性的影響。采用PI單染、AnnexinⅤ/PI雙染法分別檢測(cè)Wnt2b分子對(duì)肝癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　6.采用western blot、定量PCR、MTT法檢測(cè)Wnt2b對(duì)肝癌細(xì)胞的作用是否通過(guò)活化Wnt信號(hào)通路。
　　7.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用皮下腫瘤組織荷瘤，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并瘤內(nèi)注射的方法觀察Wnt2b對(duì)腫瘤的影響，并用流式檢測(cè)腫瘤組織和肝臟中淋巴細(xì)胞亞群的變化。
　　研究結(jié)果<

8、br>　　1.TLR2抑制肝癌細(xì)胞系的增殖，TLR4則促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的增殖。TLR2抑制肝癌細(xì)胞的干性，TLR4則促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性。
　　2.TLR4促進(jìn)肝癌細(xì)胞系中β-catenin的表達(dá)及入核。與TLR4缺失小鼠的肝癌組織相比，WT小鼠肝癌組織中β-catenin表達(dá)上調(diào)，且入核β-catenin增多。
　　3.不同TLR缺失小鼠的肝組織中，Wnts的表達(dá)不同。TLR2激動(dòng)劑刺激人肝癌細(xì)胞系HepG2，Wnt2分子，W

9、nt2b分子表達(dá)下調(diào)。在TLR4激動(dòng)劑LPS刺激下，Wnt5a分子表達(dá)下調(diào)，Wnt2b分子表達(dá)上調(diào)。
　　4.TLR2抑制肝癌細(xì)胞系中Wnt2b的表達(dá)，TLR4促進(jìn)肝癌細(xì)胞系中Wnt2b的表達(dá)。
　　5.Wnt2b促進(jìn)肝癌細(xì)胞系的增殖。Wnt2b促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性。Wnt2b抑制肝癌細(xì)胞系的凋亡，促進(jìn)抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)，但不影響肝癌細(xì)胞系的周期。
　　6.Wnt2b對(duì)肝癌的促進(jìn)作用是通過(guò)活化Wnt/

10、β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的;沉默β-catenin后，Wnt2b則不能發(fā)揮促進(jìn)肝癌的作用。
　　7.Wnt2b促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)并通過(guò)抑制腫瘤組織中NK細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)論及意義
　　1本文首次發(fā)現(xiàn)TLR2分子和TLR4分子在肝癌過(guò)程中對(duì)Wnt2b表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)TLR4分子促進(jìn)β-catenin的活化，為T(mén)LR信號(hào)通路與Wnt信號(hào)通路建立了聯(lián)系。
　　2首次發(fā)現(xiàn)Wnt2b對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的促進(jìn)作用，并闡明了其