特異性DcR3-siRNA對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有逐步上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害人民的健康。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)和相應(yīng)的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)進(jìn)入靶細(xì)胞，使靶細(xì)胞發(fā)生凋亡，是機(jī)體免疫系統(tǒng)清除腫瘤細(xì)胞的常見(jiàn)方式，而腫瘤細(xì)胞表達(dá)死亡因子的誘捕受體是腫瘤逃避

2、機(jī)體免疫殺傷的機(jī)制之一。近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的TNFR超家族成員DcR3通過(guò)影響FasL、LIGHT和TLlA的促凋亡作用和免疫調(diào)節(jié)作用而抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究表明HCC組織存在DcR3的過(guò)表達(dá)，影響}tCC細(xì)胞的凋亡，且HCC患者DcR3的表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期、浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移有關(guān)。這些研究結(jié)果提示，若能抑制DcR3的表達(dá)則有助于阻抑腫瘤的發(fā)展與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由

3、與靶基因序列同源的雙鏈RNA(dotlble—stranded RNA，dsRNA)啟動(dòng)的一種序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，其介導(dǎo)子是21—25nt的小干擾RNA(short interfering RNA，siRNA)，由細(xì)胞內(nèi)的dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(dsRNA specific eradonuclease，Dicer)酶切產(chǎn)生。由于siRNA具有特異性高、抑制作用強(qiáng)、穩(wěn)定性高、細(xì)胞攝取相對(duì)容易等優(yōu)點(diǎn)，因此，RNAi技術(shù)目前已

4、經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究和基因治療方面。本研究擬通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制HCC細(xì)胞系HepG2中DcR3的表達(dá)，檢測(cè)DcR3干擾后Hep62細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)特性的改變，從而探討DcR3在HCC發(fā)生發(fā)展與浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用。 材料與方法： 1.應(yīng)用RT—PCR方法檢測(cè)人HCC細(xì)胞系HepG2、癌旁肝細(xì)胞系QSG-7701及正常肝細(xì)胞系HL-7702中DcR3的表達(dá)情況。 2.設(shè)計(jì)并合成針對(duì)DcR3基因的特

5、異性siRNA，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000將siRNA轉(zhuǎn)染至高表達(dá)DcR3的HCC細(xì)胞系HepG2，通過(guò)熒光顯微鏡下觀察和應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定和檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。 3.應(yīng)用半定量RT—PCR方法篩選有效的靶序列，將篩選出的有效靶序列轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)其對(duì)HepG2細(xì)胞DcR3蛋白表達(dá)的影響。 4.應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的改變。 5.應(yīng)用流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期的

6、變化。 6.應(yīng)用流式細(xì)胞儀、DNA ladder方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。 7.通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外遷移能力的變化。 結(jié)果：1.人HCC細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中DcR3 mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)，而癌旁肝細(xì)胞系QSG-7701和正常肝細(xì)胞系HL-7702細(xì)胞中無(wú)DcR3 mRNA表達(dá)。 2.LipofectamineTM2000能有效地將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率約為85％。 3.各特異性DcR3

7、-siRNA均有抑制DcR3 mRNA表達(dá)的作用，其中以siRNA4的作用更明顯，干擾作用達(dá)62.9％，siRNA1、siRNA2、siRNA3的干擾作用分別為60.7％、32.1％、23.O％：轉(zhuǎn)染siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4組的DcR3 mRNA表達(dá)與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組對(duì)DcR3 mRNA的表達(dá)無(wú)影響，與空白對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

8、P>0.05)。選擇抑制作用最明顯的siRNA4轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞作為特異性組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞DcR3蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)(++--+++)，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞蛋白呈陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)(--+)，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組與前三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 4.MTT實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染后24h、48h及96h特異性DcR3-siR

9、NA4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞吸光度值明顯低于空白對(duì)照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖抑制率在24h、48h及96h分別為20.71％、35.00％和34.04％。 5.流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞周期：特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，G1期細(xì)胞比例增多而G2/M期細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<

10、0.01)。 6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率為(22.97±2.10)％，明顯高于空白對(duì)照組(1.17±0.32)％、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(1.44±0.43)％及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(1.22±O．40)％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。DNA ladder檢測(cè)結(jié)果顯示，特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組DNA ladder陽(yáng)性率為83.3％，明顯高于空白對(duì)照組(0％)、脂

11、質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(0％)及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組(0％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 7.特異性DcR3-siRNA4轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相對(duì)遷移率在24h、48h及96h均低于空白對(duì)照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，而空白對(duì)照組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組及非特異性siRNA轉(zhuǎn)染組每?jī)山M間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論：特異性DcR3-siRNA能有效抑制肝癌細(xì)胞系Hep