非典型趨化因子受體CCRL1對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性的影響.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(HCC)是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，我國(guó)是肝癌的高發(fā)國(guó)家，約占全球肝癌病例一半以上[2]。雖然肝癌研究已取得很大進(jìn)展，但由于肝癌的疾病過(guò)程進(jìn)展迅速、具有極高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向，致使肝癌總體療效仍然不佳。目前，肝腫瘤切除術(shù)和肝移植仍然是治療肝細(xì)胞肝癌的最有效的標(biāo)準(zhǔn)方案[3]，術(shù)后5年內(nèi)仍有50％-70％復(fù)發(fā)率。因此探索肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制，了解腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，預(yù)測(cè)患者預(yù)后，尋找有效的抑制途徑，并在復(fù)發(fā)高危人群中進(jìn)行防治成為進(jìn)一

2、步提高肝癌生存率的關(guān)鍵。
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟的復(fù)雜動(dòng)態(tài)過(guò)程。只有從微環(huán)境與肝癌相互作用的角度進(jìn)行了綜合研究，才能全面、深刻認(rèn)識(shí)肝癌發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的內(nèi)在機(jī)制。在這一過(guò)程中有多種因素如細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞外蛋白酶和血管生成因子等參與。越來(lái)越多的研究表明趨化因子及其受體與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，特別是在腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)、遷徙轉(zhuǎn)移、血管形成以及免疫細(xì)胞在腫瘤的浸潤(rùn)方面可能起到關(guān)鍵的作用。
　

3、　本研究主要探討非典型的趨化因子受體CCRL1對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性的影響。利用組織芯片技術(shù)對(duì)240例原發(fā)性肝癌手術(shù)切除的患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中CCRL1的表達(dá)明顯降低，并且低表達(dá)組的患者預(yù)后要明顯差于高表達(dá)組。隨后通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，調(diào)控CCRL1在肝癌細(xì)胞系的表達(dá)，通過(guò)一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究CCRL1的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲轉(zhuǎn)移方面的影響，最后探討CCRL1抗腫瘤效應(yīng)的可能機(jī)制，為防治肝癌提供新的可能靶點(diǎn)。
　

4、　第一部分 CCRL1在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義研究
　　本研究旨在探索CCRL1在癌、癌旁組織以及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，以及表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性
　　首先對(duì)240例原發(fā)性肝癌手術(shù)切除的患者的癌和癌旁組織進(jìn)行CCRL1的免疫組化染色，并通過(guò)Image-Pro Plus6.0軟件(IPP，Media Cybernetics)對(duì)染色照片進(jìn)行平均光密度的測(cè)定。然后運(yùn)用Real-time RT-PCR和Western b

5、lot技術(shù)在6種肝癌細(xì)胞系中檢測(cè)CCRL1的表達(dá)情況。最后將患者CCRL1的染色情況與相關(guān)臨床資料進(jìn)行了綜合分析，判斷CCRL1作為患者預(yù)后指標(biāo)的價(jià)值。
　　本研究顯示，CCRL1在癌組織中的表達(dá)要明顯低于癌旁組織(P=0.015)，可見(jiàn)在癌組織中存在CCRL1的缺失。對(duì)細(xì)胞系的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，CCRL1在不同的肝癌細(xì)胞系中存在表達(dá)差異，特別是在MHCC97H(97H)，MHCC97L(97L)和MHCCM3(M3)這三株細(xì)胞胞系中，

6、隨著細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的提高(97L＜97H＜M3)，CCRL1的表達(dá)同步降低(97L＞97H＞M3)，這提示CCRL1可能具有抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛能。240例患者的臨床及隨訪資料顯示，CCRL1的低表達(dá)與肝癌的血管侵犯(P=0.038)和腫瘤低分化(P=0.037)顯著相關(guān)。低表達(dá)CCRL1的患者，其總生存率(P＜0.001)和無(wú)瘤生存率(P=0.002)要顯著低于高表達(dá)組。Cox回歸多因素分析顯不，CCRL1與腫瘤數(shù)目、血管侵犯一樣，

7、是評(píng)價(jià)患者總生存(hazard ratio，HR=0.579;95％ confidence interval，CI=0.411-0.816; P=0.002)和無(wú)瘤生存(HR=0.657;95％ CI=0.462-0.934; P=0.019)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　以上結(jié)果表明，低表達(dá)CCRL1的肝癌細(xì)胞惡性程度高，患者的預(yù)后差。對(duì)CCRL1表達(dá)量的檢測(cè)有助于對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)以及高危病例的預(yù)防性治療。
　　第二部分調(diào)節(jié)C

8、CRL1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響
　　本研究旨在通過(guò)建立細(xì)胞及動(dòng)物模型，探索CCRL1在體外以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響。
　　利用慢病毒載體在97L和M3細(xì)胞系中分別轉(zhuǎn)染shCCRL1敲除質(zhì)粒和CCRL1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，從而構(gòu)建97L-shCCRL1和M3-CCRL1穩(wěn)定細(xì)胞系。隨后借助Cell-IQ系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后的增殖能力的變化;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力的變化;Transwell小室

9、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力的改變。進(jìn)一步通過(guò)建立裸鼠皮下成瘤和原位成瘤模型，研究轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞成瘤能力和肺轉(zhuǎn)移情況。同時(shí)通過(guò)ELISA檢測(cè)了細(xì)胞上清和小鼠原位成瘤瘤體內(nèi)的CCL19和CCL21的含量。
　　結(jié)果顯示，體外實(shí)驗(yàn)中下調(diào)CCRL1的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力都明顯提高，而且上清CCL19和CCL21的量也顯著上升。反之，過(guò)表達(dá)CCRL1后，增殖、遷移、侵襲能力和CCL19和CCL21的量均下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，低表達(dá)組成

10、瘤的大小顯著高于高表達(dá)組(P＜0.05)，且具有更多的肺轉(zhuǎn)移(P＜0.05)。
　　體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，CCRL1能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，降低遷移和侵襲能力，并提示CCRL1可能成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。
　　第三部分 CCRL1對(duì)肝細(xì)胞癌生物學(xué)特性影響機(jī)制的研究
　　為了探討CCRL1抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的內(nèi)在機(jī)制，本研究從腫瘤細(xì)胞本身和對(duì)微環(huán)境的改變兩方面入手。一方面，CCRL1通過(guò)降低其配體(CCL19，CCL21

11、)的濃度，從而影響腫瘤細(xì)胞上這些配體另外的受體(CCR7)的功能，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤的作用。另一方面，CCRL1高表達(dá)后也能引起一些趨化因子的上調(diào)，而這些趨化因子與一些淋巴細(xì)胞的募集有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)主要集中在對(duì)腫瘤浸潤(rùn)的B淋巴細(xì)胞的研究。
　　首先對(duì)HCC患者肝癌組織的連續(xù)切片進(jìn)行了免疫組化染色，指標(biāo)包括CCRL1，CCL19，CCL21和CCR7。借助western blot技術(shù)，在已建立的細(xì)胞系97L-shCCRL1對(duì)多條信號(hào)通路的分

12、子進(jìn)行了檢測(cè)，并運(yùn)用siRNA技術(shù)下調(diào)了CCR7后檢測(cè)了腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力以及信號(hào)通路的變化。另一方面，通過(guò)不連續(xù)梯度離心將浸潤(rùn)組織的CD20+B淋巴細(xì)胞分出，運(yùn)用細(xì)胞流式和免疫熒光技術(shù)對(duì)其表型和產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行鑒定，并通過(guò)和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接作用。
　　免疫組化結(jié)果顯示，CCRL1的表達(dá)與CCL19、CC L21和CCR7存在呈顯著負(fù)相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示CCRL1下調(diào)后，Akt/GSK

13、-3β的磷酸化程度明顯上升，提示CCRL1可能通過(guò)該信號(hào)通路對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖侵襲進(jìn)行調(diào)控，而這一過(guò)程受到腫瘤自身CCR7的影響。浸潤(rùn)組織的B淋巴細(xì)胞主要集中在腫瘤交界區(qū)，交界區(qū)中的B細(xì)胞表現(xiàn)為IgD-IgG+CD27-CD38-的表型，能夠產(chǎn)生IFN-γ和IL-12，同時(shí)還能夠通過(guò)granzyme B和TRAIL對(duì)腫瘤進(jìn)行直接殺傷，并且其密度還與患者的預(yù)后相關(guān)。
　　綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為高表達(dá)腫瘤細(xì)胞的CCRL1，能夠降低CCL