趨化因子和趨化因子受體在母-胎界面的表達(dá)及其生物學(xué)作用.pdf

1、該研究擬通過如下實(shí)驗(yàn)研究,以解析趨化因子及其受體在母-胎界面的生物學(xué)調(diào)控作用:1、早孕期絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(VCT)和絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞(EVCT)的分離、培養(yǎng)及鑒定.應(yīng)用不同胰酶消化步驟,收集人早孕期絨毛細(xì)胞的VCT及EVCT并分別培養(yǎng).應(yīng)用倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察VCT及EVCT的形態(tài)學(xué)特征;免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞來源及純度.結(jié)果顯示胰酶短期、溫和消化獲得的EVCT,可生長于Matrigel上,并表達(dá)特異性標(biāo)志物c-crbB-2.延長消

2、化時間、增加胰酶濃度獲得的VCT,種植于塑料或玻璃培養(yǎng)器皿上,可聚集并融合形成合體滋養(yǎng)細(xì)胞.VCT不表達(dá)c-erbB-2.因此采用不同的胰酶消化及體外培養(yǎng)條件,可簡便、快速獲得高純度人早孕期VCT及EVCT.2、趨化因子受體和配體在早孕期人滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)及其生物學(xué)功能.首先分離早孕期人滋養(yǎng)細(xì)胞,RT-PCR系統(tǒng)檢測了18種趨化因子受體在滋養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄水平,并篩選選出普遍高水平轉(zhuǎn)錄的趨化因子受體(CXCR4,CXCR6).免疫細(xì)胞化學(xué)和免

3、疫組化證實(shí)早孕期人滋養(yǎng)細(xì)胞可翻譯CXCR4.MTT實(shí)驗(yàn)揭示外源給予及滋養(yǎng)細(xì)胞自分泌的SDF-1具有促滋養(yǎng)細(xì)胞增殖效應(yīng);而PD98059則能拮抗外源SDF-1的促增殖效應(yīng).Western blot證實(shí)SDF-1顯著增加滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化水平.該研究表明,早孕期人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)SDF-1/CXCR4,該趨化因子配體、受體對相互作用,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化,從而以自分泌、旁分泌方式促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖.3、早孕期人蛻膜CD56<'b

4、right>CD16<'->NK細(xì)胞趨化因子受體表達(dá)及特異性募集機(jī)制.收集早孕期蛻膜組織,免疫磁珠分選CD56<'bright>CD16<'->NK細(xì)胞;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測CD56<'bright>CD16<'->NK細(xì)胞中18種趨化因子受體的轉(zhuǎn)錄水平,篩選出高表達(dá)趨化因子受體(即CXCR4及CXCR3).原位雜交及免疫組化分析CXCR4特異性配體SDF-1在早孕胎盤的定位表達(dá);ELISA檢測早孕滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液

5、中SDF-1α的濃度水平.趨化試驗(yàn)研究重組人SDF-1α(rhSDF-α)及滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液對蛻膜CD56<'bright>CD16<'->NK細(xì)胞的趨化作用.研究結(jié)果表明人早孕期蛻膜CD56<'bright>CD16<'->NK細(xì)胞高水平轉(zhuǎn)錄CXCR4,而滋養(yǎng)細(xì)胞則表達(dá)并分泌CXCR4的配體SDF-1.SDF-1趨化、募集CD56<'bright>CD16<'->NK細(xì)胞至蛻膜局部,從而有助于形成蛻膜獨(dú)特的免疫微環(huán)境;通過滋養(yǎng)細(xì)胞其

6、他分子(如HLA-G)訓(xùn)導(dǎo)蛻膜NK細(xì)胞,以維持母-胎免疫耐受.4、HIV-1協(xié)同受體及相關(guān)趨化因子在人胎盤組織的表達(dá)及可能的作用.半定量RT-PCR檢測早、中、晚孕期胎盤及早孕滋養(yǎng)細(xì)胞CXCR4、CCR5 mRNA水平;免疫組化和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測早孕胎盤及原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞CXCR4、CCR5蛋白表達(dá).結(jié)果顯示各孕期胎盤表達(dá)CXCR4及CCR5 mRNA;CXCR4蛋白定位于滋養(yǎng)細(xì)胞,而CCR5蛋白定位于絨毛基質(zhì)中.研究表明滋養(yǎng)細(xì)胞同時表