趨化因子CXCL16-CXCR6在人早孕期母—胎界面的表達及調(diào)控作用.pdf

1、趨化因子是一組通常由70-90個氨基酸組成的小分子量(8．14KD)蛋白質(zhì)，通過與細胞膜相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合而發(fā)揮多種生物學(xué)作用。趨化因子家族目前包含50種趨化因子及18種趨化因子受體。其中CXCLl6是最新被鑒定的趨化因子，在體內(nèi)以細胞結(jié)合型和分泌型兩種方式存在，發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，CXCR6被確認為它的唯一受體。既往我們研究發(fā)現(xiàn)，人早孕滋養(yǎng)細胞高度轉(zhuǎn)錄CXCR6，因此推測其上游信號CXCLl6可能參與滋養(yǎng)細胞的生物學(xué)調(diào)控。因此

2、我們圍繞母胎界面局部表達的CXCR6和CXCLl6進行了本課題的研究設(shè)計，以探討這一獨特的趨化因子對在母胎界面的表達特征及其生物學(xué)意義。 1．人早孕母胎界面主要功能細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 母胎界面的胎兒面主要由滋養(yǎng)細胞組成，我們按照本實驗室建立的方法，進行了絨毛滋養(yǎng)細胞、絨毛外滋養(yǎng)細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定，收獲的細胞純度達90-95％。 母胎界面母體面的蛻膜主要由蛻膜基質(zhì)細胞和蛻膜免疫細胞構(gòu)成。以往國內(nèi)外關(guān)于蛻膜免

3、疫細胞的研究多限于單色熒光標記白細胞抗原，難以真實反映各亞群細胞的實際數(shù)量。我們在研究中，設(shè)計了酶消化、Percoll密度梯度離心、短期培養(yǎng)結(jié)合的方法同時分離純化蛻膜基質(zhì)細胞和蛻膜免疫細胞，應(yīng)用多色熒光抗體同時標記免疫細胞表面抗原，以鑒定蛻膜免疫細胞亞群。該方法分離得到的蛻膜基質(zhì)細胞經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定細胞純度可達99％；我們采用三色、雙色、單色熒光直接標記法，分別分析早孕婦女蛻膜、外周血NK細胞(CD3'CD56+CDl6‘和CD3-C

4、D56+CDl6+)、NKT細胞(CD3+CD56+)、γδT細胞(CD3+γδTCR+)、T細胞(cD3+和單核細胞(cDl4+)的陽性率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CD56+CDl6-NK細胞約占蛻膜免疫細胞總數(shù)的(67．02±18．33)％，T細胞占(11．05±7．22)％，單核細胞占(5．28±0．29)％，NKT細胞占(235±1．62)％。早孕婦女外周血T淋巴細胞較正常生育期婦女明顯下降(p<0．05)；而早孕婦女外周血NK細胞、NKT細

5、胞、單核細胞數(shù)量與對照組相比無顯著差異。 2．趨化因子CXCLl6及其受體CXCR6在人早孕母胎界面的表達 本研究首先采用Real-timeRT-PCR和免疫化學(xué)的方法從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平分析滋養(yǎng)細胞和蛻膜基質(zhì)細胞CXCLl6／CXCR6的表達。發(fā)現(xiàn)細胞滋養(yǎng)細胞、合體滋養(yǎng)細胞和絨毛外滋養(yǎng)細胞均高表達CXCLl6／CXCR6。蛻膜基質(zhì)細胞雖高水平轉(zhuǎn)錄CXCR6，低水平轉(zhuǎn)錄其配體CXCLl6；但CXCLl6和CXCR6在蛋白水平

6、的表達均很低。我們隨后采用多色熒光標記的流式細胞術(shù)分析了蛻膜免疫細胞CXCR6的表達水平。結(jié)果顯示TbT細胞CXCR6的平均表達率最高，達(87．29±6．95)％；單核細胞和NKT細胞CXCR6呈中度表達，其陽性率分別為(47．71±6．04)％、(44．14±4．4)％；T細胞CXCR6的平均表達率為(30．39±5．23)％；而蛻膜CD56+CDl6'NK細胞和CD56+CDl6+NK細胞幾乎不表達CXCR6，其陽性率分別為(4．

7、79±1．3)％和(4．84±0．77)％，且兩者之間無顯著性差異(P>0．05)。 3．CXCLl6對人早孕滋養(yǎng)細胞的自分泌調(diào)控作用 原代培養(yǎng)人滋養(yǎng)細胞100小時，收集培養(yǎng)上清檢測CXCLl6的分泌水平。ELISA分析發(fā)現(xiàn)：滋養(yǎng)細胞能夠持續(xù)分泌趨化因子CXCLl6，當(dāng)種植密度為1×10~cells／mi時，48h累積分泌濃度為1．65ng／ml，100h累積分泌濃度為2．69ng／ml。應(yīng)用IFN-?處理后，可啟動滋養(yǎng)

8、細胞內(nèi)CXCLl6的合成，上調(diào)CXCLl6的表達和分泌水平。而經(jīng)ADAMl0處理后，只能加速滋養(yǎng)細胞表面CXCLl6的釋放，不能促進CXCLl6的合成。 外源性CXCLl6處理滋養(yǎng)細胞，3H-TdR摻入法和MTT比色法分析其對滋養(yǎng)細胞增殖能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCLl6能夠有效誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞的增殖，而且呈明顯的量效依賴關(guān)系，其促增殖效應(yīng)可被相應(yīng)中和性抗體阻斷。在CXCLl6誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞增殖后，我們采用Westemblot方法分析了

9、P13K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Akt的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)CXCLl6能夠迅速磷酸化滋養(yǎng)細胞中的Akt，在10-30min達最高峰，效應(yīng)持續(xù)時間不少于2小時。外源性CXCLl6處理滋養(yǎng)細胞，Matrigel侵襲試驗分析其對滋養(yǎng)細胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)rhCXCLl6濃度低達10ng／ml時，即可明顯促進滋養(yǎng)細胞的侵襲：當(dāng)rhCXCLl6濃度為200ng／ml時，侵襲指數(shù)最高，這種侵襲效應(yīng)可被CXCLl6的中和性抗體阻斷。因此，CXCLl6不

10、僅促進滋養(yǎng)細胞的增殖，而且促進其侵襲，在誘導(dǎo)增殖中可能啟動了細胞內(nèi)的P13K途徑。由于滋養(yǎng)細胞在各個分化階段均表達CXCLl6和CXCR6，據(jù)此可推測趨化因子CXCLl6可能參與滋養(yǎng)細胞的分化和胎盤形成。 4．人早孕期滋養(yǎng)細胞分泌CXCLl6參與蛻膜免疫細胞的募集和粘附我們首先分離了人外周血單個核細胞，流式細胞術(shù)分析各群細胞CXCR6的表達水平。隨后采用Transwell法分析CXCLl6和滋養(yǎng)細胞條件培養(yǎng)液(TCM)對PBMC

11、趨化能力的影響。結(jié)果顯示，CXCLl6可選擇性地趨化外周T細胞、76T細胞和單核細胞，對CD56+CDl6+NK細胞也具微弱的趨化效應(yīng)；來源于滋養(yǎng)細胞的TCM對于NK細胞、T細胞和單核細胞均顯示很強的趨化活性；而抗CXCLl6抗體可以完全或部分抑制CXCLl6或TCM的趨化效應(yīng)。有趣的是，被TCM或CXCLl6趨化后的PBMC的構(gòu)成比例與蛻膜免疫細胞比例非常相似。 之后，我們分離了蛻膜免疫細胞重復(fù)了上述實驗，得到了類似的結(jié)果。即

12、CXCLl6選擇性地趨化蛻膜T細胞、75T細胞和單核細胞，TCM對于蛻膜的三種主要免疫細胞即NK細胞、T細胞、單核細胞均表現(xiàn)很強的趨化能力，經(jīng)CXCLl6和TCM趨化后的蛻膜免疫細胞構(gòu)成比與趨化前相似。因此早孕期滋養(yǎng)細胞合成和分泌的趨化因子CXCLl6不僅引導(dǎo)外周T細胞、75T細胞和單核細胞進入蛻膜，還使它們停留在滋養(yǎng)細胞附近的蛻膜組織中。 綜上所述，本研究首先建立了母胎界面滋養(yǎng)細胞、蛻膜基質(zhì)細胞和蛻膜免疫細胞的分離方法；系統(tǒng)研