ING5、CXCL16-CXCR6在胃癌侵襲、轉移中的作用及相關分子機理研究.pdf

1、第一部分，目的:
　　 胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一,雖然近年發(fā)病率有所下降,但仍然嚴重威脅人類健康。雖然化療、放療、生物治療和基因治療在胃癌治療中廣泛應用,但胃癌侵襲和轉移仍然是生存率無法大幅提升的主要原因。近年來分子遺傳學研究證明,胃癌是異型性極強的惡性腫瘤,胃癌發(fā)生和發(fā)展是多階段、多基因和多因素參與的復雜過程,這些基因主要包括癌基因、抑癌基因及DNA錯配修復基因等。其中基因突變、雜合性丟失和啟動子甲基化修飾等導致抑癌基

2、因功能降低或缺失在腫瘤發(fā)生和演進中發(fā)揮重要作用,成為腫瘤學研究的一個熱點,其中之一就是生長抑制基因(Inhibitorofgrowth,ING)家族。
　　 生長抑制基因(ING)包括5個家族成員。其中,ING5定位于人染色體2q37.3,含有8個外顯子和7個內含子,編碼長為5233bp的cDNA中1068個核苷酸翻譯成由240個氨基酸組成的28kDa蛋白質。從氨基到羧基末端ING5蛋白含有亮氨酸拉鏈樣(LZL)、新保守區(qū)(NC

3、R)、核定位序列(NLS)和植物同源結構域(PHD)。LZL結構域在DNA修復、凋亡誘導和染色質重建中發(fā)揮重要作用,NCR結構域在基因表達和染色質重建過程中參與組蛋白乙酰轉移酶(HAT)復合體形成,NLS結構域決定了ING5蛋白核定位。因其具有抑制細胞生長并以p53蛋白依賴方式誘導細胞凋亡的生物學作用,ING5被認為是一種抑癌基因。ING5可誘導p53蛋白乙?；?在乙?；痯53蛋白協(xié)同作用下形成HAT復合體或激活微染色體維持蛋白(MCM

4、),分別在調節(jié)細胞S期DNA復制或組蛋白乙酰化中發(fā)揮作用。有研究顯示,ING5可以通過調節(jié)p53蛋白激活周期素依賴激酶抑制劑p21/waf1啟動子活性促進p21其表達,進而導致細胞G1期阻滯。
　　 很多研究發(fā)現(xiàn),惡性腫瘤發(fā)生過程中存在ING蛋白下調或者缺失,癌細胞中ING表達參與凋亡調節(jié)。許多體內外實驗也發(fā)現(xiàn)ING蛋白調節(jié)細胞凋亡的作用。ING5的過表達可以導致集落形成效能的降低和S期細胞的減少,并且以P53依賴的方式誘導細胞

5、凋亡。我們之前的研究顯示結腸癌中ING5蛋白或mRNA組織含量升高,兩者癌變過程中核ING5蛋白發(fā)生了漿移動和表達下調,核ING5表達與腫塊大小、侵襲深度、去分化、臨床病理分期或不良預后呈負相關,而漿ING5表達與腫瘤侵襲深度、淋巴管侵襲、淋巴結轉移或臨床病理分期呈正相關。
　　 隨著診斷和治療技術的不斷提高和廣泛開展,胃癌的發(fā)病率和病死率在全世界范圍均有所下降,但是胃癌仍是威脅人類的高發(fā)惡性腫瘤之一,而且病死率仍排在第二位。病

6、理和遺傳學研究提示胃黏膜上皮不典型增生大部分最終要惡變,然而,其分子機制尚未闡明。因此,我們推測ING5表達異常在胃癌發(fā)生和演進中發(fā)揮重要作用。本文研究了ING5在胃正常粘膜、不典型增生、癌組織和胃癌細胞系中的表達,并進行臨床病理學資料分析和預后分析,以期發(fā)現(xiàn)ING5在胃癌進展過程中作用。
　　 方法：
　　 一、細胞培養(yǎng):
　　 五種胃癌細胞系,MKN28(高分化腺癌)、MKN45(低分化腺癌)、AGS(中分化

7、腺癌)、KATO-Ⅲ(低分化腺癌)和GT-3(未分化腺癌)受贈于日本理化研究所。其中,MKN28、MKN45和KATO-Ⅲ在ERPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),GT-3在DMEM@培養(yǎng),AGS在Hams/F-12中培養(yǎng),每種培養(yǎng)液中均加10%FBS,濃度為100units/ml。所有細胞經過收集、離心、PBS洗滌,然后提取總蛋白。細胞蛋白在應用核漿蛋白分離試劑盒分離(78833;PierceBiotechnology,Rockford,IL

8、)。再次收集細胞,經過離心、PBS洗滌后,置入10%甲醛中固定,然后進行石蠟包埋,用于進一步實驗。
　　 二、胃癌標本的收集
　　 胃癌石蠟標本來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科1985年至2003年手術切除病例和KousereinTakaokaHospital1993年至2002年的手術切除病例,其中胃癌組織(GC)429例,癌旁非癌組織(NNM)119例。另外還有50例不典型增生來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內窺鏡

9、中心1990年至2009年的活檢標本。另外還收集臨床手術新鮮標本21例,包括癌組織和相對應的癌旁非癌組織,標本置于-80℃深低溫冰箱保存直至實驗所用。所有病例術前均未經過放化療和其他輔助治療。我們對每例患者進行電話隨訪。
　　 三、病理學檢查及組織芯片(tissuemicroarray,TMA)的制備
　　 所有蠟塊均切成4-μm厚的切片,然后進行HE染色,鏡下確定組織學診斷和其他鏡下特點。鏡下確定每例切片的目的區(qū)域,然

10、后再組織芯片機上制成2mm直徑組織,放于組織芯片盒內(TMA;AZUMAYAKIN-1,Tokyo,Japan),之后對芯片盒內的組織在進行石蠟包埋,最后切成4-μm的切片進行免疫組化實驗。
　　 四、蛋白印記(Westernblot)檢測ING5的蛋白水平
　　 (1)將收集的病理標本,加裂解液(20mmol/LTris/HclPH:7.5,50mmol/LNacl,0.1mmol/LNa3Vo4,25mmol/LNa

11、F,2mmol/LEDTA/EGTA,1mmol/LDTT,1mgl/L亮肽酶/抑肽酶)200μL,冰上放置30min,超聲破碎20sec/次,3-4次。12000rpm離心20min取上清,即為總蛋白。
　　 (2)收集細胞,用預冷的PBS洗滌2次,1000rpm/min離心5min棄上清。同上方法提取總蛋白。
　　 (3)考馬斯亮藍法測定蛋白含量,取90μg總蛋白上樣,經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后將蛋白

12、電轉移到NC膜上。根據(jù)分子量裁膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入ING5一抗(1:1000)4℃過夜,辣根過氧化酶標記的二抗室溫作用1h。每次孵育后均用含5%的Tween-20的TBS洗脫3次,每次5min。待NC膜稍干后,在膜上滴加適量的ECL顯影并上機掃描測灰度值。每組實驗至少重復3次。(4)最后,StrongBuffer液洗膜,在加入內參β-actin單克隆抗體(1:1000)孵育,按上述步驟顯影并測灰度值,進行統(tǒng)計學分析。

13、>　　 五、RT-PCR、電泳&測序
　　 以提取并反轉錄的cDNA#3模板擴增目的基因:25μL反應體系含有Taq酶0.125μL和100ng模板cDNA。反應條件:95℃變性10分鐘在經過32個周期95℃變性30秒,60℃(ING5)/55℃(β-actin)退火45秒,72℃延伸1分鐘,最后一次延伸7分鐘。擴增的產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,UVP凝膠成像檢測,檢測灰度值進行統(tǒng)計學分析。最后,將PCR產物進行膠回收(QI

14、AGEN試劑盒),然后進行測序。
　　 六、實時RT-POR
　　 為了進一步確定RT-PCR的結果,我們又進行了實時RT-PCR檢測。兩步法擴增目的基因,95℃30s進行預變性;95℃5s,60℃34s40個循環(huán)進行PCR反應。20μL反應體系含有10μLSYBRPremixExTaq酶,0.08μL引物和0.4μLofROXReferenceDye和1μL模板cDNA。反應結束后獲取Ct值,并根據(jù)2-△△Ct進行計算

15、得出比例。
　　 七、免疫組化
　　 將切片先用2甲苯脫蠟,用酒精脫水,在進行抗原修復(微波爐高溫高壓法,抗原修復液選用pH值6.0的檸檬酸鈉緩沖液)。然后用3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶,再用5%BSA阻斷非特異性結合。之后用ING5抗體孵育4℃過夜(1:100),第二天用二抗孵育1小時,最后用DAB顯色,蘇木精復染,然后常規(guī)進行脫水、透明、封片。每次孵育前均在微波爐中雜交30分鐘,每次處置前均用TBST洗三次。不加

16、一抗做為陰性對照。
　　 結果：
　　 一、ING5在五種胃癌細胞系中的表達
　　 通過蛋白印記和免疫組化,我們發(fā)現(xiàn)ING5在胃癌五種細胞系的細胞核中均有表達。為了從mRNA水平進一步驗證,我們對五種胃癌細胞的RNA進行RT-PCR實驗,結果發(fā)現(xiàn)ING5mRNA在五種胃癌細胞系中均有表達,且表達水平相似。進一步,我們將PCR產物進行測序檢測1NG5是否存在突變。
　　 二、INGS5在胃癌組織中的表達

17、r>　　 在18例胃癌新鮮組織及對應正常粘膜中檢測蛋白水平,發(fā)現(xiàn)6例(33.3%)癌組織高于正常,8例(44.4%)低于正常,4例(22.2%)無差別。經過統(tǒng)計學分析顯示,在蛋白水平癌組織和正常粘膜的ING5表達無差別。進一步,我們又對15例標本進行了mRNA水平的檢測,結果顯示,12例(80%)癌組織高于正常,1例低于正常,2例無差別。經過統(tǒng)計學分析顯示,在mRNA水平癌組織和正常粘膜的ING5表達有顯著差別。我們又進行了實時RT-

18、PCR,證實了我們的結果。
　　 三、ING5的表達與胃癌患者臨床病理學因素的關系以及生存分析
　　 核ING5的表達與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結轉移和UICC分期呈負相關(P＜0.05),與性別、淋巴管浸潤和靜脈浸潤無關(P＞0.05)。核ING5在老年患者中的表達要高于年輕患者(P＜0.05)。相對應,漿ING5的表達與浸潤深度、靜脈浸潤、淋巴結轉移和UICC分期呈正相關(P＜0.05),而與腫瘤大小、性別、年齡、淋

19、巴管浸潤和核ING5表達無關(P＞0.05)。與彌漫性胃癌相比,腸型胃癌中的核ING5高表達,而漿ING5正相反。
　　 我們對343例胃癌患者進行了隨訪(0.4個月-9.3年,平均78.0個月)。生存分析應用K-M法,單因素分析結果顯示核ING5的表達與患者的累計生存期呈負相關(P＜0.05),而漿ING5無關(P＞0.05)。進一步經過Cox回歸分析,結果提示核ING5的表達并不是影響胃癌患者預后的獨立危險因素(P＞0.05

20、)。浸潤深度、UICC分期和Lauren分型是影響核ING5和胃癌患者預后關系的因素。
　　 結論：
　　 1.ING5蛋白表達參與胃癌發(fā)生的早期階段,并且影響胃癌的生物學行為;
　　 2.ING5的核漿移動對胃癌的生物學行為起到重要作用;
　　 3.但是,胃癌中核ING5蛋白漿移動的分子機制還不清楚,有待進一步研究。
　　第二部分， 目的：
　　 胃癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之

21、一,各種化療和基因生物治療也效果不佳,胃癌的侵襲和轉移是生存率明顯降低的主要原因。近年來分子遺傳學研究證明胃癌是異型性極強的惡性腫瘤,其侵襲和轉移是多階段多基因參與的結果,已經闡明的分子機制仍然無法解釋所有的發(fā)生事件。因此深入研究胃癌侵襲和轉移的分子機制,尋找新的分子治療靶點,將有助于提高療效,并為分子分型和分子分期提供線索。
　　 化學趨化因子屬于小分子分泌細胞因子,其主要的作用是可以促進各種白細胞的運動。由于白細胞的定向運動

22、與腫瘤細胞的侵襲、轉移十分相似,人們更加關注其在腫瘤侵潤、轉移中的作用。目前,已有大量研究證實化學趨化因子在各種腫瘤細胞中的表達,并進一步顯示其在腫瘤進展和器官選擇性轉移中的作用。
　　 CXCL16是新近發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子,人類CXCL16基因定位于染色體17p13上,與已知的其它趨化因子相隔。CXCL16是唯一一個以兩種存在形式的趨化因子:膜結合型和分泌型。CXCL16是繼Fractalkine之后第二個以膜結合的方式存在的

23、趨化因子,它在以跨膜結合的形式表達于樹突狀細胞表面時,可起到細胞表面的粘附分子的作用,與其它粘附分子協(xié)作介導與表達CXCR6的T細胞和NKT細胞結合。在ADAM10的分裂剪切作用下,膜結合型的CXCL16可脫落形成具有趨化活性的可溶性形式,招募表達CXCR6的活化的T細胞和NKT細胞。在目前已知的所有的趨化因子受體中,只有CXCR6是CXCL16的唯一受體。CXCR6是一個7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體,含有7段跨膜區(qū),基因位于第3號染色體上。

24、
　　 化學趨化因子及其受體在腫瘤的生長、侵潤、血管形成和轉移中起到了重要的作用,這一點已經得到眾多學術團體的認可,因此,探討CXCL16、CXCR6與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關系及相關分子生物學機理不但可以推動惡性腫瘤病因學和治療學的發(fā)展,而且可為惡性腫瘤靶向化療藥物研發(fā)和基因治療提供科學的實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、細胞培養(yǎng):
　　 九種胃癌細胞系,MGC-803、BGC-823、MKN28、MK

25、N45、AGS、KATO-Ⅲ、SGC-7901、HGC-27和GES-1。其中,MGC-803、BGC-823、MKN28、MKN45和KATO-Ⅲ在RFMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),GES-1和SGC-7901在DMEM中培養(yǎng),AGS在Hams/F-12中培養(yǎng),HGC-27在MEM中培養(yǎng),每種培養(yǎng)液中鈞加10%FBS,濃度為100units/ml。所有細胞經過收集、離心、PBS洗滌,然后提取總蛋白。再次收集細胞,經過離心、PBS洗滌后,置

26、入10%甲醛中固定,然后進行石蠟包埋,用于進一步實驗。
　　 二、胃癌標本的收集
　　 胃癌石蠟標本來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院腫瘤外科1985年至2003年手術切除病例和KousereinTakaokaHospital1993年至2002年的手術切除病例,其中胃癌組織(GC)429例,癌旁非癌組織(NNM)119例。50例不典型增生來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內窺鏡中心1990年至2009年的活檢標本。另外還收集臨床

27、手術新鮮標本28例,包括癌組織和相對應的癌旁非癌組織,標本置于-80℃深低溫冰箱保存。所有病例術前均未經過放化療和其他輔助治療。我們對每例患者進行電話隨訪。
　　 三、病理學檢查及組織芯片(tissuemicroarray,TMA)的制備
　　 所有蠟塊均切成4-μm厚的切片,然后進行HE染色,鏡下確定組織學診斷和其他鏡下特點。胃癌分期按照UICC標準。組織學類型按照Lauren分型標準。另外,同時觀察腫瘤的浸潤深度、淋

28、巴管及靜脈浸潤。
　　 鏡下確定每例切片的目的區(qū)域,然后再組織芯片機上制成2mm直徑組織,放于組織芯片盒內,之后對芯片盒內的組織在進行石蠟包埋,最后切成4-μm的切片進行免疫組化實驗。
　　 四、蛋白印記(Westernblot)檢測CXCR6的蛋白水平
　　 (1)將收集的病理標本,加裂解液(20mmol/LTris/HclPH:7.5,50mmol/Lnacl,0.1mmol/LNa3Vo4,25mmol/L

29、NaF,2mmol/LEDTA/EGTA,1mmol/LDTT,1mgl/L亮肽酶/抑肽酶)200μL,冰上放置30min,超聲破碎20sec/次,3-4次。12000rpm離心20min取上清,即總蛋白。
　　 (2)收集細胞,用預冷的PBS洗滌2次,1000rpm/min離心5min棄上清。按照上述方法提取總蛋白。
　　 (3)考馬斯亮藍法測定蛋白含量,取90μg總蛋白上樣,經10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后

30、將蛋白電轉移到NC膜上。根據(jù)分子量裁膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1h,加入CXCR6一抗4℃過夜,辣根過氧化酶標記的二抗室溫作用1h。每次孵育后均用含5%的Tween-20的TBS洗脫3次,每次5min。待NC膜稍干后,在膜上滴加適量的ECL顯影并上機掃描測灰度值。
　　 (4)最后,StrongBuffer液洗膜,在加入內參β-actin單克隆抗體(1:1000)孵育,按上述步驟顯影并測灰度值,進行統(tǒng)計學分析。
　　 五、

31、RT-PCR、電泳&測序
　　 以提取并反轉錄的cDNA為模板,擴增目的基因:25μL反應體系含有Taq酶0.125μL和100ng模板cDNA。反應條件:94℃變性2分鐘在經過33個周期94℃變性30秒,58℃/55℃(β-actin)退火30秒,72℃延伸30秒,最后一次延伸10分鐘。擴增的產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,UVP凝膠成像檢測,檢測灰度值進行統(tǒng)計學分析。最后,將PCR產物進行膠回收((QIAGEN試劑盒),然后進

32、行測序。
　　 六、ELISA
　　 收集胃癌患者血清及細胞培養(yǎng)液上清,經過離心后-80℃保存。購置人CXCL16ELISA試劑盒,按說明書進行CXCL16分泌蛋白的檢測。
　　 七、MTT比色法測定細胞生長曲線
　　 取對數(shù)生長期的胃癌細胞AGS和SGC-7901,制成單細胞懸液,以每孔1×105個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔200μL培養(yǎng)液,培養(yǎng)細胞24h。加入濃度CXCL16濃度分別為0μmol/

33、L,50μmol/L,100μmol/L,150μmol/L,200μmol/L,每組3個復孔,并設空白孔。作用48h后,每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μl,37℃繼續(xù)孵育4h,終止培養(yǎng)。選擇490nm波長,酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔光吸收值,以藥物濃度為橫軸,細胞增殖比率為縱軸繪制細胞生長曲線。
　　 八、細胞侵襲分析
　　 在小室濾膜(8um孔徑)的內面鋪以10ug的ECM膠,4℃冰箱過夜,形成一個基質屏障層。在

34、孔培養(yǎng)板內加入600ul正常培養(yǎng)液。收集上述細胞,重懸于培養(yǎng)基中,終濃度為5×105/ml。將細胞懸液加到上室內,每小室100ul。正常條件培養(yǎng)24h。將小室取出,濾膜用甲醇固定1h。后用吉姆薩染色,顯微鏡下照相并計數(shù)。
　　 九、流式細胞術檢測細胞周期
　　 在含濃度為150μmol/LCXCL16的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)上述兩種細胞。離心2000r/min,5min,棄上清后加入2mLPBS重復離心一次。用0.5mlPBS重

35、懸細胞至單細胞懸液,并使其迅速在4℃預冷的75%的乙醇溶液中固定,之后在4℃下離心2000r/min,5min,棄上清后加入5mL冷PBS再離心一次,棄去上清。在避光條件下加入1mLPI染液重懸細胞至單細胞懸液,室溫孵育30min,用流式細胞儀分析樣品。
　　 結果：
　　 一、OXOL16、CXOR6在胃癌細胞系中的表達
　　 通過RT-PCR篩選,我們發(fā)現(xiàn)CXCL16和CXCR6在九種胃癌細胞系中均有表達,且

36、表達水平相似。
　　 二、CXCR6在組織中的蛋白表達水平
　　 在27例胃癌新鮮組織及對應正常粘膜中檢測蛋白水平,發(fā)現(xiàn)17例(63.O%)癌組織高于正常,5例(18.5%)低于正常,5例(18.5%)無差別。經過統(tǒng)計學分析顯示,在蛋白水平癌組織和正常粘膜的CXCR6表達有顯著差別。
　　 三、CXCL16和CXCR6在組織中的mRNA表達水平
　　 在28例胃癌新鮮組織及對應正常粘膜中檢測CXCL16和

37、CXCR6mRNA表達水平。CXCL16的結果顯示,18例(64.3%)癌組織高于正常,3例低于正常,7例無差別;而CXCR6的結果顯示,6例癌組織高于正常,18例(64.3%)低于正常,4例無差別。經過統(tǒng)計學分析顯示,CXCL16mRNA水平癌組織高于正常粘膜的表達,結果有顯著差別,而CXCR6mRNA水平癌組織低于正常粘膜的表達,結果也有統(tǒng)計學意義。
　　 四、胃癌患者血清及細胞上清中CXCL16含量的檢測
　　 我

38、們將胃癌患者的血清按說明書步驟加入ELISA試劑盒并進行檢測,結果與患者的臨床病理學指標進行統(tǒng)計學分,結果顯示,患者血清中CXCL16的分泌與患者的年齡、淋巴管浸潤和Lauren分型相關(P＜0.05)。
　　 之前經過篩選,CXCL16在每種胃癌細胞系中都有表達,我們選擇兩種細胞AGS和SGC-7901,通過ELISA的方法檢測CXCL16在IL-1β和TNFα誘導下的分泌情況。結果顯示,IL-1β和TNFα均能顯著提高兩種細

39、胞分泌CXCL16的量,并且呈現(xiàn)濃度依賴方式,即隨IL-1β和TNFα濃度的增加,CXCL16分泌的濃度也逐漸增加。
　　 五、MTT比色法測定細胞生長曲線
　　 MTT結果顯示隨著CXCL16濃度加大,兩種細胞的活力均逐漸增加,而且呈現(xiàn)濃度依賴方式。
　　 六、流式細胞術檢測細胞凋亡
　　 AGS和7901隨CXCL16的濃度增加,凋亡逐漸減少
　　 七、細胞侵襲分析
　　 AGS和79

40、01隨CXCL16的濃度增加,侵襲力逐漸增加(P＜0.05)。
　　 八、流式細胞術檢測細胞周期
　　 流式細胞術檢測細胞周期,結果顯示兩種細胞隨著CXCL16濃度的增加,G2期細胞比例逐漸增加。
　　 結論：
　　 1.CXCL16/CXCR6與胃癌的侵襲、轉移相關,而且影響胃癌細胞的生物學行為;
　　 2.許多細胞因子如IL-1β、TNFα影響CXCL16的分泌,從而促進癌細胞的侵襲和轉移;<