趨化因子類病毒受體的研究.pdf

1、趨化因子系統(tǒng)指的是一些小分子炎癥因子及其受體,他們參與調(diào)節(jié)感染、炎癥以及組織修復(fù)相關(guān)的免疫反應(yīng),并且可以在胚胎形成階段調(diào)控多種細(xì)胞的遷移。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)50多種趨化因子和19種趨化因子受體。太實(shí)驗(yàn)為了研究趨化因子類病毒受體,我們選擇了嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒(SARS Coronavius,SARS-CoV)N蛋白和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Viru

2、s,PRRSV)GP5蛋白作為研究對(duì)象,分別構(gòu)建了人CXCL16和豬CXCR4真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,通過體內(nèi)外結(jié)合實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦檢測(cè),探討了SARS-CoVN與CXCL16是否可相互結(jié)合。構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CXCL12和pcDNA3.1-CXCR4,已證明重組的CXCL12具有趨化作用,重組的CXCR4的初步證明不能與GP5相結(jié)合。
　　 1.CXCL16與SARS-CoV N蛋白在細(xì)胞內(nèi)外相互作

3、用的研究
　　 為了研究宿主細(xì)胞內(nèi)SARS-CoVN蛋白的相互作用蛋白,探索功能聯(lián)系。構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-N1/SARS-COVN、pdsRed2-N1/CXCL16并用磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,構(gòu)建和純化了帶HIS標(biāo)簽的SARS-COVN-GFP融合蛋白并用于體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。激光共聚焦檢測(cè)顯示SARS-CoVN與CXCL16在293FT細(xì)胞的胞漿共定位,提示其相互作用可能是直接結(jié)合。熒光顯微鏡觀察到純化的SARS-C

4、OVN-GFP融合蛋白在細(xì)胞外可與表達(dá)在的細(xì)胞膜重組CXCL16結(jié)合上,說明二者能相互結(jié)合。
　　 2.豬趨化因子受體CXCR4真核表達(dá)以及與PRRSV的GP5蛋白相互作用的初步研究
　　 為了研究豬CXCR4的生物學(xué)功能,采用RT-PCR的方法從豬脾臟組織中擴(kuò)增豬CXCL12基因的cDNA,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CXCR4,再轉(zhuǎn)染至HEK293FT細(xì)胞后,24h后經(jīng)間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)CXCR4的表達(dá)

5、,同時(shí)采用RT-PCR的方法從PRRSV中擴(kuò)增GP5基因的cDNA并構(gòu)建PRRSV的GP5蛋白的真核表達(dá)載體pEGFP-N1/GP5,轉(zhuǎn)染293FT后收集純化帶GFP標(biāo)記的GP5蛋白,觀測(cè)其于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR4是否相互作用。結(jié)果顯示,雙酶切鑒定和核酸序列分析證實(shí)pcDNA3.1-CXCR4真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞后,IFA能夠檢測(cè)到CXCR4蛋白的表達(dá)。但GP5蛋白未能與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CXCR

6、4的293FT細(xì)胞結(jié)合,初步說明二者不能相互作用。
　　 3.豬趨化因子CXCL12的克隆與真核表達(dá)
　　 為了研究豬CXCL12的生物學(xué)功能,采用RT-PCR的方法從豬脾臟組織中擴(kuò)增豬CXCL12基因的cDNA,構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-CXCL12,再轉(zhuǎn)染至HEK293FT細(xì)胞后,24h后經(jīng)間接免疫熒光(IFA)和免疫印跡(western blot)檢測(cè)CXCL12的表達(dá),用鎳柱純化表達(dá)的6×HIS—CXCL

7、12融合蛋白并用體外趨化小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)純化的CXCL12蛋白對(duì)外豬周血單個(gè)核細(xì)胞,大鼠和小鼠的脾臟單個(gè)核細(xì)胞以及人淋巴細(xì)胞H9細(xì)胞系趨化能力。結(jié)果顯示,雙酶切鑒定和核酸序列分析證實(shí)pcDNA3.1-CXCL12真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞后,IFA能夠檢測(cè)到CXCL12蛋白的表達(dá),western blot顯示表達(dá)的融合蛋白分子量約為17KD,純化的6×HIS-CXCL12融合蛋白對(duì)豬外周血單個(gè)核細(xì)胞具有趨化能力,但不能趨