趨化因子及其受體在重癥肌無力患者胸腺組織的異常表達和作用.pdf

1、目的:
　　 胸腺是中樞免疫器官，是T淋巴細胞發(fā)育分化成熟的重要器官。正常的胸腺功能對人體免疫功能的維持十分重要。如果人體的免疫平衡被打破，就可能引發(fā)各種免疫性疾病。淋巴細胞執(zhí)行人體的免疫功能，對人體的免疫狀況起著非常重要的作用.主要包括T細胞、B細胞、NK細胞、NKT細胞等。近年來，對淋巴細胞的分化和功能、以及與疾病發(fā)生關系的研究報道很多，在某些方面也有顯著進展。其中趨化性細胞因子在淋巴細胞發(fā)育、分化、成熟、及其功能上的作用，

2、越來越受到關注。淋巴細胞的發(fā)育受多種細胞表面分子和細胞因子的調控，趨化因子(chemokines)是一類對細胞具有趨化作用的細胞因子，能直接引導白細胞定向遷移，并具有活化和遷移細胞的功能。淋巴干/祖細胞由骨髓經(jīng)血液向胸腺的遷移和定植、成熟淋巴細胞歸巢和動態(tài)分布、各種免疫細胞的分化、活化等均受到趨化因子的影響和調節(jié)。
　　 重癥肌無力是由抗體介導的，與T淋巴細胞和免疫功能異常相關的自身免疫性疾病。已有研究報道，多數(shù)MG患者胸腺細胞

3、異常增生，胸腺細胞亞群比例異常。胸腺組織中出現(xiàn)淋巴結樣的T細胞區(qū)和富含B細胞的生發(fā)中心是MG患者胸腺異常增生的典型病理改變，且從MG增生型胸腺組織分離純化的B細胞能產(chǎn)生抗乙酰膽堿受體(AchR)抗體，胸腺切除后抗AchR抗體滴度降低，患者癥狀好轉。為探討MG患者胸腺中胸腺細胞亞群異常及B細胞生發(fā)中心形成的原因，本文通過基因芯片、熒光定量PCR、趨化實驗、流式細胞術和免疫組化等方法對MG患者胸腺組織趨化因子及其受體的異常表達和作用進行了分

4、析。旨在比較MG患者和正常對照組胸腺組織中趨化因子及其受體的表達情況，探討趨化因子及其受體在MG患者胸腺組織的異常表達和作用。
　　 方法:
　　 1.研究對象：MG患者12例，胸腺組織病理類型為增生型；先天性心臟病患者10例，胸腺組織病理檢查未見異常，做為對照。
　　 2.胸腺組織趨化因子及其受體mRNA的基因芯片分析：無菌取MG患者和先心病患者手術切除的胸腺組織，提取總RNA，而后將其反轉錄成cDNA，再進行

5、體外轉錄合成生物素標記的cDNA，并與基因芯片進行雜交，通過化學發(fā)光法檢測MG患者和正常胸腺組織的基因表達情況，篩選出差異性表達的趨化因子及其受體。
　　 3.熒光定量PCR驗證趨化因子及其受體的表達：提取胸腺組織總RNA，將其反轉錄合成cDNA，從芯片結果差異性表達的趨化因子及受體中選取幾種，采用熒光定量PCR對芯片結果進行驗證。
　　 4.MG患者胸腺組織趨化因子CCL25的分布情況：制作胸腺組織石蠟切片，采用免疫組

6、化方法檢測趨化因子CCL25在MG和正常胸腺組織表達的差異。
　　 5.胸腺組織提取液對胸腺細胞的趨化作用：從胸腺組織中無菌分離制備胸腺細胞懸液和胸腺組織提取液，采用趨化實驗和流式細胞術觀察MG患者胸腺組織提取液對MG胸腺細胞的趨化作用，與正常胸腺組織提取液對正常胸腺細胞的趨化作用對比，對兩者的趨化指數(shù)進行比較分析。
　　 6.MG患者外周血淋巴細胞表達趨化因子受體CCR9水平：無菌制備外周血淋巴細胞懸液，采用流式細胞術

7、觀察病例組和對照組淋巴細胞亞群和趨化因子受體CCR9的表達情況。
　　 結果:
　　 1、MG患者胸腺趨化因子及其受體mRNA的表達：基因芯片結果顯示，在檢測的70種趨化因子及其受體中，有49種基因在MG患者和對照組胸腺組織表達量均低，有21種基因在MG和對照組胸腺呈顯著表達。通過對顯著表達基因的對比分析，發(fā)現(xiàn)CCL3、CCL22、CCL25、CCR7、CCR9、CXCL12基因在MG患者胸腺表達顯著高于對照組，CCL2

8、、CX3CL1、CXCL10、CXCR6、IL-8基因在MG患者胸腺組織表達顯著低于對照組。對差異表達基因進行熒光定量PCR驗證，結果與基因芯片基本相符。
　　 2、胸腺組織CCL25的表達：免疫組化結果顯示，與正常胸腺組織相比，趨化因子CCL25在MG胸腺組織呈現(xiàn)高表達，且主要表達于皮髓交界處胸腺基質胞。
　　 3、胸腺組織提取液對胸腺細胞的趨化作用：MG胸腺提取液對CD8+單陽性細胞有較強的趨化作用；用SPSS17.

9、0對MG組和正常對照組趨化指數(shù)進行兩組獨立樣本的t檢驗進行統(tǒng)計分析顯示，MG組的趨化指數(shù)顯著高于對照組，P＜0.05，具有統(tǒng)計學意義。
　　 4、外周血淋巴細胞CCR9表達：流式結果分析顯示，外周血淋巴細胞上CD4+CCR9-細胞在MG組顯著高于正常對照組，CD8+CCR9+、CD19+CCR9+細胞在MG組均顯著低于正常對照組。
　　 結論:
　　 MG患者胸腺組織中存在趨化因子及其受體的表達異常，CCL25及