Mcl-1特異性shRNA聯(lián)合凋亡素治療肝細(xì)胞癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌是全球第5大惡性腫瘤，在腫瘤相關(guān)死亡中排在第3位。手術(shù)切除和肝移植仍是當(dāng)前可能治愈肝癌的主要方法，但絕大多數(shù)患者被確診時(shí)已是晚期，失去手術(shù)時(shí)機(jī)。此外，現(xiàn)有的化療藥物并不能提高肝癌患者的生存率，因此，探求新的更有效的肝癌治療方法是當(dāng)前迫切需要解決的問題。
　　 髓細(xì)胞白血病基因-1 (myeloid cell leukemia-1 mcL-1)是bcl-2家族成員，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞生存，抑制細(xì)胞凋亡。McL-1在肝癌

2、組織中明顯呈高表達(dá)狀態(tài)，被認(rèn)為與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。凋亡素（apoptin）是雞貧血病毒VP3基因編碼的蛋白，能選擇性地誘導(dǎo)人轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)正常細(xì)胞無(wú)誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 RNA干擾(RN Ain terference,RNAi)技術(shù)是一種能夠有效抑制目的基因表達(dá)的基因治療工具，已被廣泛應(yīng)用于目的基因功能研究和腫瘤的基因治療中。本研究針對(duì)mcL-1mRNA設(shè)計(jì)、構(gòu)建并篩選出表達(dá)小發(fā)卡狀RNA (short hair

3、pin RNA,shRNA)的重組表達(dá)質(zhì)粒，觀察mcL-1特異性shRNA對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響，以及與凋亡素聯(lián)合對(duì)肝癌增殖和凋亡的作用，為肝癌的治療提供新的策略。
　　 第一部分：靶向mcL-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　 目的：設(shè)計(jì)并構(gòu)建靶向mcL-1基因并含有EGFP基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。
　　 方法：根據(jù)shRNA的設(shè)計(jì)原則、載體pGenesiL-1.1的酶切位點(diǎn)以及GenBank中m

4、cL-1mRNA序列，設(shè)計(jì)并合成3對(duì)編碼shRNA的寡核苷酸鏈，將寡核苷酸鏈退火形成互補(bǔ)雙鏈，再克隆至載體pGenesiL-1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒mcL-1.1～mcL-1.3，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株,提取質(zhì)粒,行酶切鑒定和DNA測(cè)序鑒定。
　　 結(jié)果：所構(gòu)建的重組質(zhì)粒mcL-1.1～mcL-1.3經(jīng)酶切鑒定及DNA測(cè)序證實(shí)符合設(shè)計(jì)要求，證實(shí)質(zhì)粒mcL-1.1～mcL-1.3 構(gòu)建成功。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建了靶向人mcL-

5、1基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒,為一步利用shRNA表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行肝細(xì)胞癌治療研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分：McL-1特異性shRNA的篩選及其對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的:從所構(gòu)建的3個(gè)shRNA質(zhì)粒中篩選出對(duì)mcL-1基因抑制作用最強(qiáng)的質(zhì)粒，并觀察該質(zhì)粒對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響。
　　 方法:經(jīng)Lipofectamine 2000介導(dǎo)將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒mcL-1.1～mcL-1.3及陰性對(duì)照質(zhì)粒HK轉(zhuǎn)染

6、HepG2。轉(zhuǎn)染后48 h于熒光顯微下觀察并計(jì)算質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染率，并分別利用RT-PCR和western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mcL-1 mRNA和蛋白，確定3種質(zhì)粒對(duì)mcL-1基因的抑制效率，篩選出對(duì)mcL-1基因抑制作用最強(qiáng)的質(zhì)粒。采用Hoechst染色觀察所選質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞48 h后的凋亡形態(tài)學(xué)改變，及PI單染行流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2的凋亡率。
　　 結(jié)果:重組質(zhì)粒mcL-1.1～mcL-1.3和陰性對(duì)照質(zhì)粒HK對(duì)He

7、pG2的轉(zhuǎn)染率分別為64.00%±3.77%、64.20%±2.10%、63.70%±3.34%和62.5%±2.42%，各組間轉(zhuǎn)染率無(wú)明顯差異（P=0.59）。質(zhì)粒mcL-1.1～mcL-1.3組mcL-1 mRNA的相對(duì)含量分別為0.61±0.02、0.56±0.02和0.46±0.01，mcL-1蛋白的相對(duì)含量分別為0.54±0.01、0.48±0.03、0.36±0.01，與HK（mRNA：0.95±0.00，蛋白：0.88±0

8、.01）和空白對(duì)照組（mRNA:0.97±0.01,蛋白：0.90±0.03）相比均存在顯著性差異（均P=0.00）。質(zhì)粒McL-1.3對(duì)mcL-1mRNA和蛋白的抑制率分別為52.27±0.00%和58.98±0.01%，均高于mcL-1.1（mRNA:36.26±0.12%,蛋白：38.80±0.02%）和mcL-1.2（mRNA:41.47±0.13%,蛋白：45.70±0.02%）（均 P=0.00)。轉(zhuǎn)染mcL-1.3的細(xì)胞經(jīng)

9、Hoechst染色出現(xiàn)明顯凋亡核形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。經(jīng)流式檢測(cè)，mcL-1.3轉(zhuǎn)染組HepG2的凋亡率明顯高于HK組（7.74%±0.97% VS 2.81%±0.46% P=0.00）
　　 結(jié)論:成功篩選出靶向mcL-1基因的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒，其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)的mcL-1基因表達(dá)具有明顯抑制作用，并可直接導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡。利用shRNA沉默McL-1基因可能是肝癌基因治療的有效途徑之一。
　　 第三部分：McL

10、-1特異性shRNA聯(lián)合凋亡素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響
　　 目的:觀察mcL-1特異性shRNA與凋亡素聯(lián)合作用對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　 方法:利用質(zhì)粒mcL-1.3和pGensiL-1.2構(gòu)建靶向mcL-1基因但不含有EGFP基因的shRNA表達(dá)質(zhì)粒pmcL-1，然后將質(zhì)粒pmcL-1和pcDNA3.0-vp3轉(zhuǎn)入肝癌細(xì)胞HepG2內(nèi)，利用RT-PCR和western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mcL-1和vp3

11、的mRNA與蛋白含量及細(xì)胞色素C含量，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，Annexin V-FITC/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。
　　 結(jié)果:所構(gòu)建的重組質(zhì)粒pmcL-1經(jīng)酶切及DNA測(cè)序證實(shí)符合設(shè)計(jì)要求，證實(shí)構(gòu)建成功。經(jīng)RT-PCR和western blot檢測(cè)顯示，pmcL-1+pcDNA3.0-vp3轉(zhuǎn)染組和pcDNA3.0-vp3轉(zhuǎn)染組vp3陽(yáng)性，pmcL-1轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組vp3均為陰性。PmcL-1+pcD

12、NA3.0-vp3組的vp3 mRNA含量為0.83±0.02，蛋白含量為1.48±0.06，與pcDNA3.0-vp3組相比無(wú)明顯差異（mRNA:0.78±0.37,P=0.20；蛋白：1.40±0.08,P=0.81）。質(zhì)粒pmcL-1、pcDNA3.0-vp3及pmcL-1+pcDNA3.0-vp3均可明顯下調(diào)細(xì)胞內(nèi)mcL-1mRNA和蛋白水平，促進(jìn)線粒體細(xì)胞色素C的釋放。其中pmcL-1+pcDNA3.0-vp3組的mcL-1

13、mRNA含量為0.34±0.05，蛋白含量為0.38±0.02,與pmcL-1組（mRNA:0.46±0.03,蛋白0.44±0.03）和pcDNA3.0-vp3組（mRNA:0.43±0.01,蛋白:0.43±0.01）相比，差異均有顯著性（均P<0.05)。PmcL-1+pcDNA3.0-vp3組的細(xì)胞色素C含量為1.21±0.09，明顯高于pmcL-1組（0.96±0.03，P=0.01）和pcDNA3.0-vp3組（0.98±0

14、.02，P=0.01）。與陰性對(duì)照及空白對(duì)照相比，質(zhì)粒pmcL-1、pcDNA3.0-vp3和pmcL-1+pcDNA3.0-vp3處理組的HepG2細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后1～5天的生長(zhǎng)均明顯受到抑制，其中質(zhì)粒pcDNA3.0-vp3對(duì)HepG2的生長(zhǎng)抑制作用在各時(shí)間點(diǎn)均強(qiáng)于pmcL-1（均P=0.00），pmcL-1聯(lián)合pcDNA3.0-vp3對(duì)HepG2生長(zhǎng)的抑制作用較兩者單獨(dú)作用時(shí)均強(qiáng)（均P<0.05）。質(zhì)粒pmcL-1、pcDNA3.0-

15、vp3及pmcL-1+pcDNA3.0-vp3均可誘導(dǎo)HepG2的凋亡，其中質(zhì)粒pcDNA3.0-vp3轉(zhuǎn)染24h、48h和72h的凋亡率分別為12.00±1.57%、22.1±2.82%和41.80±3.37%，均高于相應(yīng)時(shí)間pmcL-1組的凋亡率（分別為8.60±0.78%,P=0.03；11.07±0.95%,P=0.03；15.00±1.44%，P=0.00），而pmcL-1聯(lián)合pcDNA3.0-vp3轉(zhuǎn)染HepG2 24h、4