抗凋亡蛋白Mcl-1及Siah-1S在細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制研究.pdf

1、Mcl-1作為抗凋亡Bcl-2家族蛋白成員之一，可以阻斷多種凋亡誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，然而Mcl-1抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制并沒有被完全地弄清楚。 在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Mcl-1可以和促凋亡Bcl-2家族蛋白Puma相互作用，它們之間的相互作用分別由Mcl-1的BH1結(jié)構(gòu)域和Puma的BH3結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)。免疫熒光結(jié)果顯示Mcl-1和Puma可以共定位于線粒體，暗示Mcl-1和Puma之間的結(jié)合是發(fā)生在線粒體上的。進(jìn)一步的研究結(jié)

2、果表明Mcl-1．可以抑制Puma誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而且Mcl-1的BH1結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄淇筆uma誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡起著重要的作用。有意思的是，Mcl-1的蛋白穩(wěn)定性可以被Puma提高，而且這種Mcl-1蛋白穩(wěn)定性的提高是由于和Puma的直接結(jié)合而引起的，因?yàn)閷uma的BH3結(jié)構(gòu)域去除之后，Puma就不再能提高M(jìn)cl-1的蛋白穩(wěn)定性，我們同時(shí)也證明了Puma結(jié)合Mcl-1只能部分而不能完全地阻止Mcl-1的快速降解。最后我們發(fā)現(xiàn)除了PEST和

3、BH1結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)Mcl-1的快速降解之外，還存在其它的降解信號(hào)，而且位于Mcl-1蛋白的C末端。我們的這些結(jié)果第一次清楚地闡明了Mcl-1可以和Puma相互作用，而且暗示了Mcl-1可能通過和Puma結(jié)合而提高自身穩(wěn)定性最終行使抗凋亡的功能。 另外，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)促凋亡Bcl-2家族蛋白Noxa的蛋白水平在喜樹堿(CPT)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中可以被上調(diào)，而且這一過程是不依賴于p53的。除此之外，我們證明了P13K/Akt信號(hào)通路在

4、CPT誘導(dǎo)的Noxa上調(diào)過程中起著非常重要的作用。luciferase assay以及CREB knock-down的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示CREB介導(dǎo)了CPT誘導(dǎo)的Noxa轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。更重要的是，用RNAi的方法將Noxa的蛋白水平抑制之后可以顯著地抑制CPT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，暗示Noxa在CPT誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著非常重要的作用。有意思的是，Mcl-1的蛋白水平也可以通過P13K/Akt信號(hào)通路而被CPT上調(diào)。通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，

5、我們證明了不管有沒有CPT處理的情況下Noxa都可以和Mcl-1相互作用，說明Noxa和Mcl-1之間應(yīng)該存在一個(gè)平衡，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。通過抑制Mcl-1的蛋白水平以及在細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)Mcl-1的實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)Mcl-1蛋白水平的抑制會(huì)使得細(xì)胞對(duì)于CPT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更加的敏感，而過量表達(dá)Mcl-1則可以顯著地抑制CPT以及CPT和LY294002誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。綜合這些結(jié)果說明N0×a和Mcl-1之間的平衡可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于CPT誘導(dǎo)

6、細(xì)胞凋亡的敏感度。綜上所述，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示了Mcl-1可以通過和Puma以及Noxa相互作用從而發(fā)揮其抗凋亡功能。 Siah-1(seven in absentia homolog)可以和SIP(Siah-1-interacting protein)，Skp1，以及Ebi相互作用形成一個(gè)泛素連接酶復(fù)合物從而降解β-catenin。在我們的研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的Siah-1剪切異構(gòu)體并將它命名為Siah-1S，Siah-1

7、S被證明是通過自身剪切而產(chǎn)生的。有意思的是，Siah-1在剪切的過程中產(chǎn)生的內(nèi)含子并不符合經(jīng)典的內(nèi)含子邊界：GT-AG或AT-AC。通過比較Siah-1和Siah-1S的蛋白半衰期，我們發(fā)現(xiàn)Siah-1S比Siah-1更加的不穩(wěn)定；和Siah-1類似，Siah-1S也可以發(fā)生自身泛素化并最終通過泛素-蛋白酶體途徑而被降解。Siah-1S可以提高β-catenin的蛋白水平以及增強(qiáng)Tcf/Lef的轉(zhuǎn)錄活性，而且Siah-1S可以對(duì)抗Sia

8、h-1對(duì)于Etoposide誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)作用。另外我們發(fā)現(xiàn)Siah-1S不僅可以和Siah-1結(jié)合形成異源二聚體，也可以和自身形成同源二聚體。和Siah-1<'*>Siah-1二聚體不同，Siah-1<'*>Siah-1S、以及Siah-1S<'*>Siah-1S都失去了和SIP的結(jié)合能力，這個(gè)結(jié)果可以部分地解釋為什么Siah-1S可以行使Siah-1的dominant negative抑制子的作用。最后我們證明了Siah-1S