E3泛素化酶siah-1核聚集在同型半胱氨酸誘導細胞凋亡的作用機制研究.pdf

1、目的：明確高同型半胱氨酸誘導細胞凋亡的機制，探討核內(nèi)siah-1聚集在此凋亡過程中所起機制的研究。
　　方法：（1）用不同濃度同型半胱氨酸（Hcy）培養(yǎng)C6細胞，模擬高同型半胱氨酸損傷細胞模型，觀察Hcy處理后細胞活力變化，CCK-8試劑盒檢測各組細胞增值率，選定干預濃度；（2）TUNEL法檢測正常組與同型半胱氨酸處理組細胞凋亡程度；（3）實時熒光定量PCR（real-time PCR）技術(shù)測定同型半胱氨酸對C6細胞內(nèi)siah-1

2、基因、GAPDH基因的mRNA表達；蛋白免疫印跡分析(Western blot)檢測siah-1、GAPDH蛋白表達水平的影響；（4）使用免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察同型半胱氨酸處理細胞后胞內(nèi) siah-1及GAPDH的分布和亞細胞定位改變；（5）用siah-1-siRNA干擾細胞后，real-time PCR及Western blot檢測干擾效率；（6）觀察siah-1干擾后正常組與同型半胱氨酸處理組細胞核內(nèi)GAPDH蛋白表達影響

3、，免疫熒光染色激光共聚焦顯微鏡明確siah-1干擾對GAPDH核轉(zhuǎn)位改變。（7）觀察siah-1干擾后正常組與同型半胱氨酸處理組細胞內(nèi)P53及caspase3表達的影響。
　　結(jié)果：（1）CCK-8檢測細胞增殖率發(fā)現(xiàn)，同型半胱氨酸處理C6細胞48小時后，細胞增殖能力受到明顯抑制，且隨著同型半胱氨酸濃度增加，細胞增殖能力逐漸下降；（2）TUNEL染色發(fā)現(xiàn)：正常組細胞TUNEL陽性染色極少，而同型半胱氨酸處理組細胞TUNEL染色陽性明

4、顯增加，提示一定濃度的同型半胱氨酸可促進C6細胞凋亡。（3）Real-time PCR結(jié)果顯示：同型半胱氨酸誘導細胞48小時后，與對照組相比，Hcy處理組細胞內(nèi)siah-1、GAPDH mRNA表達明顯增加，且隨著同型半胱氨酸濃度增加而增加，呈濃度依賴性；（4）Western blot結(jié)果提示：同型半胱氨酸誘導細胞48小時后細胞內(nèi)siah-1、GAPDH蛋白表達也明顯增加，同樣隨著同型半胱氨酸濃度增加而增加，呈濃度依賴性；（5）免疫熒光

5、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常組細胞siah-1及GAPDH主要在細胞漿表達，細胞核少有或者無表達，而同型半胱氨酸處理組細胞核內(nèi)出現(xiàn)siah-1及GAPDH聚集現(xiàn)象；（6）用siRNA干擾后，可有效抑制細胞內(nèi)siah-1 mRNA和蛋白水平的表達；激光共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果顯示，干擾siah-1的表達可減少同型半胱氨酸所致的GAPDH的聚集及核轉(zhuǎn)位。提示了siah-1參與了同型半胱氨酸誘導的 GAPDH核轉(zhuǎn)位，形成siah-1/GAPDH復合物后，由胞漿

6、向胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位，發(fā)揮促凋亡作用。
　　結(jié)論：同型半胱氨酸誘導細胞后可誘導C6細胞凋亡，促進細胞內(nèi)siah-1、GAPDH表達增加，發(fā)生由細胞漿向細胞核的轉(zhuǎn)位；干擾siah-1后，可以減少同型半胱氨酸所致核內(nèi)siah-1及GADPH聚集現(xiàn)象。提示了siah-1參與了GAPDH由胞漿向胞核轉(zhuǎn)位的運動機制，同型半胱氨酸誘導細胞后促進siah-1/GAPDH復合物的形成，并從胞漿轉(zhuǎn)移至胞核，形成核內(nèi)聚集，最后發(fā)生細胞凋亡，而對siah-1