肺癌特異性腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的篩選及其生物學(xué)活性分析.pdf

1、研究背景 支氣管肺癌（bronchiogenic cancer）是嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率都居惡性腫瘤前列，導(dǎo)致肺癌高死亡率的重要原因是大部分肺癌在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)發(fā)展到晚期，常常伴有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。大約25-35％的肺癌患者伴有腦轉(zhuǎn)移，腦轉(zhuǎn)移病灶發(fā)展快，產(chǎn)生癥狀明顯，治療反應(yīng)差，是影響肺癌患者生存最嚴(yán)重的因素之一，所以肺癌腦轉(zhuǎn)移防治是臨床工作中迫切需要解決的難題，難點(diǎn)在于目前對(duì)于腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)理并不太清楚。目前

2、國(guó)內(nèi)外對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究仍然很少，主要的研究集中在肺癌腦轉(zhuǎn)移的診斷以及藥物、放療、手術(shù)等治療方法對(duì)腦轉(zhuǎn)移病灶的療效觀察。肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制的基礎(chǔ)研究非常薄弱，對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)理了解甚微。篩選特異性腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞株并對(duì)其生物學(xué)活性進(jìn)行分析，可對(duì)肺癌腦轉(zhuǎn)移的機(jī)理進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)而探索尋找出預(yù)防治療肺癌腦轉(zhuǎn)移的有效方法。 目的 通過(guò)反復(fù)裸鼠體內(nèi)接種人肺癌細(xì)胞株P(guān)C14，篩選出肺癌特異性腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞株，進(jìn)一步分析特異性肺癌腦

3、轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的生長(zhǎng)特點(diǎn)、生物學(xué)活性及細(xì)胞表面因子表達(dá)，并與可以部分產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移的原株及不能產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移的細(xì)胞株進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)它們之間的不同，揭示部分肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制。 方法 應(yīng)用人肺癌細(xì)胞株P(guān)C14尾靜脈注射接種裸鼠，5周后處死裸鼠，取出腦轉(zhuǎn)移腫瘤組織，行原代培養(yǎng)后再次接種裸鼠，反復(fù)幾個(gè)循環(huán)，觀察腦轉(zhuǎn)移形成情況，篩選到可特異性產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移的細(xì)胞亞株，并與部分腦轉(zhuǎn)移原株P(guān)C14、非腦轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株A549比較，分析三株不同腦轉(zhuǎn)移特性

4、的肺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的差異：應(yīng)用MTT法測(cè)定它們?cè)诩?xì)胞外基質(zhì)上的貼附活性；并應(yīng)用微孔膜孔徑為8μm的millicell小室，MTT法測(cè)由內(nèi)室遷移到外室的細(xì)胞數(shù)來(lái)分析其遷移活性；應(yīng)用細(xì)胞外基質(zhì)膠體包被millicell小室，構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜樣結(jié)構(gòu)，MTT法測(cè)定由內(nèi)室侵襲穿過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)及基底膜到達(dá)外室的細(xì)胞數(shù)量，來(lái)分析三株腫瘤細(xì)胞的侵襲活性。然后應(yīng)用SP法比較三株細(xì)胞表面VEGF、MMP-9的表達(dá)，分析兩種細(xì)胞因子的表達(dá)與細(xì)胞生物學(xué)活

5、性及轉(zhuǎn)移特性的關(guān)系。 結(jié)果 經(jīng)過(guò)4個(gè)循環(huán)后，篩選出特異性肺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞株，命名為PC14/B，一次接種可有4/5的裸小鼠產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移，余轉(zhuǎn)移特性與原株相似。篩選到的亞株P(guān)C14/B、PC14和A549的粘附系數(shù)分別為0.24±0.03、0.09±0.03和0.12±0.03（P=0.004），PC14/B粘附系數(shù)高于PC14及A549 （P分別為0.001和0.011）。MTT法測(cè)PC14/B、PC14和A549穿過(guò)微孔

6、膜遷移到外室的活性，OD值分別為0.51±0.12，0.32±0.13和0.19±0.06 （P=0.007）， PC14/B遷移能力也顯著高于PC14及A549（P 分別為0.034和0.002）；MTT法測(cè)PC14/B、PC14和A549侵襲細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的活性，OD值分別為0.69±0.17，0.38±0.06和0.27±0.06（P=0.001），PC14/B侵襲活性亦是最強(qiáng)（P 值分別為0.005和<0.001）。但是，P

7、C14和A549的大部分生物學(xué)活性無(wú)明顯差異，前者只有侵襲活性大于后者。VEGF及MMP-9在PC14/B及A549細(xì)胞表面表達(dá)為強(qiáng)陽(yáng)性+++，而PC14二者表達(dá)皆為陽(yáng)性+。 結(jié)論 應(yīng)用裸小鼠體內(nèi)反復(fù)接種肺癌細(xì)胞株，可以篩選到特異性腦轉(zhuǎn)移的肺癌細(xì)胞亞株，是建立肺癌腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的可行方法之一。VEGF、MMP-9促進(jìn)了肺癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞亞株貼附、遷移及侵襲，可能在肺癌腦轉(zhuǎn)移的過(guò)程中起重要作用，促進(jìn)了肺癌腦轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生，但V