穩(wěn)定低表達CD44的ABC型彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株的建立及其生物學活性研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 彌漫性大B細胞性淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma，DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin'slymphoma，NHL）中最常見的一種，約占成人NHL的30％～40％，為一組臨床表現(xiàn)、形態(tài)學、免疫表型和遺傳學都具有明顯異質(zhì)性的淋巴瘤。這種異質(zhì)性還體現(xiàn)在對治療反應(yīng)的不一致以及預(yù)后的差異。40％～50％的DLBCL患者可通過傳統(tǒng)的聯(lián)合化療達到持續(xù)緩解，其余的則常表現(xiàn)為原

2、發(fā)耐藥或緩解后復發(fā)。如何通過各種因素判斷患者預(yù)后，早期干預(yù)治療，是DLBCL治療成功的關(guān)鍵。國際預(yù)后指標(internationalprognosticindex，IPI)對判斷DLBCL的預(yù)后具有重大的指導意義，但它并不能反映腫瘤發(fā)生過程中的分子生物學本質(zhì)。運用基因芯片技術(shù)，根據(jù)DLBCL基因表達譜(GEP)的差異，可以將DLBCL分為三型:預(yù)后較好的生發(fā)中心B細胞樣亞型(GCB)，外周血活化B細胞樣亞型(ABC)，以及第3型(typ

3、e3)。有趣的是GCB-DLBCL和ABC-DLBCL的預(yù)后明顯不同，GCB-DLBCL接受化療的效果較好，而ABC-DLBCL化療效果不佳。導致這種現(xiàn)象的原因，目前尚不明確，但基因表達譜的差異可能是DLBCL患者預(yù)后不同的原因之一，因此尋找不同蛋白在兩種類型DLBCL的表達差異可能幫助我們找到不同的預(yù)后指標。
　　 CD44是一種重要的細胞膜表面粘附分子，也是透明質(zhì)酸的主要受體。在淋巴系統(tǒng)中，其功能與淋巴細胞的歸巢、激活及凋亡

4、密切相關(guān)。CD44在B細胞激活時表達增加，然而在進入生發(fā)中心后表達下降。隨著B細胞的進一步成熟，生發(fā)中心的后代細胞如記憶細胞和漿細胞會再度表達CD44和其它歸巢受體，以促進B細胞的再循環(huán)和歸巢。Sabine等研究發(fā)現(xiàn)CD44V主要表達于NON-GCB型的DLBCL患者，此類患者采用標準的CHOP化療方案預(yù)后不良。HorstE等證實結(jié)外的DLBCL和侵襲性DLBCL都與CD44的高水平表達有關(guān)，也提示預(yù)后不佳。因此，CD44可能是提示DL

5、BCL分型及預(yù)后的新指標。目前關(guān)于CD44在ABC-DLBCL細胞聚集、遷移、增殖和生存過程中發(fā)揮的作用及其可能的分子機制目前尚不清楚。
　　 本研究以ABC-DLBCL細胞株SUDHL2為研究對象，運用分子生物學技術(shù)構(gòu)建干擾CD44表達shRNA病毒載體，通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)將該表達載體轉(zhuǎn)入ABC-DLBCL細胞株，建立穩(wěn)定低表達CD44的ABC-DLBCL細胞株，并進一步研究CD44沉默對ABC-DLBCL細胞株生物學行為的影響

6、。
　　 材料和方法：
　　 1、分別針對3個靶點設(shè)計干擾人CD44的shRNA序列，化學合成相關(guān)序列，并與慢病毒載體連接，獲得重組載體pGFP-shCD44。
　　 2、將重組載體pGFP-shCD44質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細菌中，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，挑選陽性克隆擴大培養(yǎng)。從擴大培養(yǎng)的DH5α細菌中提取質(zhì)粒，進行雙酶切及測序鑒定，證實shRNA序列的正確連接。
　　 3、重組載體

7、以脂質(zhì)體法（LipofectamineTM2000）轉(zhuǎn)染至包裝細胞Phoenix293細胞中，48h于熒光顯微鏡下查看GFP表達情況。分別于48h和72h時收集病毒上清轉(zhuǎn)染目的細胞SUDHL2，轉(zhuǎn)染后120h后進行流式分選，將GFP+細胞進行擴大培養(yǎng)，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況并檢測GFP陽性率，提取總RNA，行RT-PCR驗證CD44基因在轉(zhuǎn)染重組載體pGFP-shCD44的細胞株中是否沉默。
　　 4、擴大培養(yǎng)成功沉默C

8、D44的SUDHL2細胞株，通過細胞形態(tài)學、MTT、流式細胞術(shù)及Transwell等方法檢測表達CD44基因?qū)UDHL2細胞株的增殖、細胞周期及遷移等的影響。
　　 5、統(tǒng)計學分析:結(jié)果采用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，細胞遷移率單因素均數(shù)比較若方差齊使用One-WayANOVA方差分析，LSD方法進行多重比較;若方差不齊則使用采用近似F檢驗（Welch方法）代替方差分析后采用DunnettT3方法進行多重比較;MTT多因

9、素均數(shù)比較使用析因設(shè)計方差分析進行統(tǒng)計;計量資料用均數(shù)±標準差表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pGFP-shCD44直接測序證實與設(shè)計的shRNA序列相符。
　　 2、以脂質(zhì)體法將重組載體pGFP-shCD44轉(zhuǎn)染至包裝細胞Phoenix293細胞中，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h后于熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光。分別于48h、72h收集病毒上清。病毒上清轉(zhuǎn)染目的細

10、胞SUDHL2后72h進行流式分選，擴大培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下可見大量GFP表達，將GFP陽性細胞擴大培養(yǎng)并提取總RNA，RT-PCR和流式細胞術(shù)證實CD44基因在SUDHL2細胞株中被沉默。
　　 3、CD44相關(guān)基因的RT-PCR結(jié)果顯示:SUDHL2、SUDHL2+pGFP和SUDHL2+pGFP-shCD44細胞中，Bcl-6、Stat-3及Mum-1均有表達，且相互之間無明顯差異。
　　 4、細胞形態(tài)學結(jié)果顯示:

11、SUDHL2細胞:細胞胞體較小，呈圓形，邊緣規(guī)則，無突起，漿少量、藍色，未見顆粒;細胞核大，染色質(zhì)致密;SUDHL2+pGFP細胞:細胞胞體小，呈圓形，邊緣不規(guī)則，可見瘤狀突起，胞漿中等，藍色，可見少量空泡。染色質(zhì)致密;SUDHL2+pGFP-shCD44細胞株:細胞胞體大，呈圓形或橢圓形，胞漿豐富，深藍色，空泡較多，無顆粒;核大而不規(guī)則，核質(zhì)疏松。
　　 5、MTT結(jié)果顯示:SUDHL2、SUDHL2+pGFP及SUDHL2+

12、pGFP-shCD44三組細胞間增值率的差別有統(tǒng)計學意義（F=69.742，P＜0.001）;0h、24h、48h和72h的OD值進行析因設(shè)計的方差分析，差別有統(tǒng)計學意義(F=525.116，P＜0.001);時間和細胞之間有交互效應(yīng)(F=11.165，P＜0.001)。其中0h時3組間的OD值無明顯差異（P=0.812），24h、48h和72h時均有明顯差異(P=0.013，＜0.001，＜0.001)，結(jié)合多重比較結(jié)果顯示:SUDH

13、L2+pGFP-shCD44細胞的增值率顯著低于與SUDHL2、SUDHL2+pGFP細胞株(P＜0.001，＜0.001)。而SUDHL2和SUDHL2+pGFP細胞株增值率的比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.647)。
　　 6、細胞凋亡檢測結(jié)果:SUDHL2+pGFP-shCD44和SUDHL2、SUDHL2+pGFP組細胞相比，凋亡細胞比例明顯增高。提示CD44沉默誘導了SUDHL2細胞的凋亡。
　　 7、Trans

14、well實驗結(jié)果顯示:方差齊性檢驗示方差齊(F=1.531，P=0.290)，三組間的遷移率比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=52.672，P＜0.001）。其中SUDHL2+pGFP-shCD44細胞的遷移率和SUDHL2、SUDHL2+pGFP細胞相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001，＜0.001)。由此可見，CD44沉默后SUDHL2細胞的遷移率降低。
　　 結(jié)論：
　　 我們成功構(gòu)建了干擾CD44表達的shRNA病毒載