腫瘤相關(guān)蛋白MDMX和MUC1生物學(xué)功能及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分MDM2/MDMX復(fù)合物對(duì)p53蛋白的調(diào)控作用研究
　　腫瘤抑制蛋白p53作為一種轉(zhuǎn)錄因子可以在多種條件下被激活,通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞對(duì)應(yīng)激條件做出的反應(yīng),例如細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡與衰老以及DNA損傷修復(fù)等,從而完成一系列生物學(xué)功能。P53的功能失活幾乎存在于所有人類腫瘤細(xì)胞中,其中在50％的腫瘤中存在p53基因的突變或缺失,其余50％則由于p53異常調(diào)控所致。在p53調(diào)控的蛋白中,MDM4和MDM2是最為主

2、要的兩個(gè)p53負(fù)性調(diào)控因子。
　　關(guān)于MDM2和MDMX對(duì)p53的調(diào)控機(jī)制一直存在爭議,其主要分歧在于兩個(gè)蛋白是以二聚體形式共同調(diào)控p53還是各自獨(dú)立對(duì)p53行使調(diào)控功能。有文獻(xiàn)報(bào)道,人類MDMX第463位半胱氨酸(MDMXC463)為MDM2形成二聚體所必需。為了揭示MDM2和MDMX對(duì)p53的調(diào)控模式,我們構(gòu)建了Mdmx/C462A基因敲入小鼠模型。研究發(fā)現(xiàn)MdmxC462a/C462A純合子出現(xiàn)胚胎死亡現(xiàn)象;進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)M

3、dmxC462A/C462A純合子小鼠胚胎發(fā)育停止于9.5天左右;TLTNEL染色和BrdU摻入研究提示胚胎致死的主要原因是細(xì)胞凋亡的增多和增殖的減少。深入分析發(fā)現(xiàn)MdmxC462A/C462A純合子小鼠胚胎細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平和活性明顯增加,提示p53活性過高導(dǎo)致胚胎致死。為進(jìn)一步證實(shí)該假設(shè)我們將MdmxWT/C462A雜合子與p53-/-小鼠交配得到MdmxWT/C462Ap53+/-雙雜合子小鼠,用該基因型雌鼠與雄鼠交配并觀

4、察后代基因型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)p53基因敲除小鼠可以完全拯救MdmxC462a/C462A純合子小鼠胚胎致死的表型,證明了MdmxC462a/C462a胚胎致死依賴于p53的作用。
　　總之,我們的研究表明Mdmx/C462A突變后阻止了MDM2和MDMX形成異源二聚體,使p53的水平和活性得到了明顯提高,從而導(dǎo)致小鼠胚胎死亡,提示MDM2和MDMX異源二聚體復(fù)合物的形成是調(diào)控p53的必要步驟。
　　第二部分MUC1在食管癌轉(zhuǎn)移中的

5、作用和機(jī)制研究
　　食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一,高發(fā)的組織侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管癌患者死亡的主要原因。研究表明MUC1和MMP13在食管癌病人中存在高表達(dá),但二者的相關(guān)性未見報(bào)道。我們對(duì)40例食管癌病人組織和20例癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組化染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC1蛋白在食管癌病人中顯著高表達(dá)。更重要的是,在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人中MUC1和MMP13都表達(dá)增強(qiáng)且有很強(qiáng)的相關(guān)性。利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株研究表明MUC1過度表達(dá)可以上調(diào)MMP1

6、3的mRNA表達(dá)水平,同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞的移行能力。進(jìn)一步通過對(duì)MMP13的啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),啟動(dòng)子中RUNX2結(jié)合位點(diǎn)突變后,MUC1對(duì)MMP13的表達(dá)調(diào)控作用喪失,提示MUC1可能通過RUNX2結(jié)合位點(diǎn)來促進(jìn)MMP13的表達(dá)。利用食管癌MUC1基因沉默細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)MUC1表達(dá)沉默后MMP13的表達(dá)水平隨之降低,細(xì)胞移行能力也明顯下降。如果將MMP13在MUC1基因沉默細(xì)胞系中過度高表達(dá)可以恢復(fù)細(xì)胞的粘附、聚集、移行和侵襲能力,表明M

7、UC1通過上調(diào)MMP13導(dǎo)致食管癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。以上結(jié)果提示MUC1可以作為新的食管癌診斷標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)。
　　第三部分 MUC1在肺癌發(fā)生和治療中的作用及機(jī)制研究
　　肺癌由于不易早期發(fā)現(xiàn)、治療方法有限,已成為死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)兩大類,NSCLC又可分為鱗

8、癌、腺癌和大細(xì)胞癌等不同類型。MUC1屬于單次跨膜的高分子量糖蛋白,在70％的實(shí)體瘤組織細(xì)胞中(包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等)高表達(dá)并失去正常極性。為了研究MUC1在肺癌發(fā)生中的作用,我們對(duì)不同類型肺癌細(xì)胞株MUC1的表達(dá)進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同病理類型的肺癌細(xì)胞當(dāng)中,MUC1的表達(dá)水平有所不同。我們選擇MUC1陰性的NCI-H460細(xì)胞株構(gòu)建了MUC1穩(wěn)定過表達(dá)細(xì)胞系;同時(shí)選擇MUC1陽性的NCI-H446細(xì)胞株構(gòu)建了MUC1基因穩(wěn)定

9、沉默細(xì)胞系。通過對(duì)兩組細(xì)胞的功能研究發(fā)現(xiàn)NCI-H460細(xì)胞株過表達(dá)MUC1可以增強(qiáng)細(xì)胞錨定非依賴生長的能力和裸鼠體內(nèi)的成瘤性,同時(shí)也可以提高細(xì)胞移行和侵襲的能力。而NCI-H446細(xì)胞株基因沉默MUC1后以上能力均顯著下降。提示MUC1的高表達(dá)可以增強(qiáng)肺癌細(xì)胞株的致瘤性和轉(zhuǎn)移能力。
　　另外,我們研究發(fā)現(xiàn)NCI-H446 MUC1基因沉默細(xì)胞株由于MUC1表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了該細(xì)胞株對(duì)紫杉醇作用的敏感性增加,流式分析結(jié)果表明MUC1基

10、因沉默后細(xì)胞G2/M期阻滯明顯增多,同時(shí)細(xì)胞凋亡增加。進(jìn)一步研究提示MUC1可能降低紫杉醇處理后BubR1的磷酸化水平,降低CyclinB1的蛋白水平,從而使細(xì)胞逃過紫杉醇導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯。對(duì)MUC1在肺癌發(fā)生和藥物耐受作用機(jī)制的深入研究將為肺癌的治療及預(yù)后提供重要的理論意義及應(yīng)用價(jià)值。
　　第四部分 AU021092條件性基因敲除小鼠模型的構(gòu)建
　　隨著人類和小鼠基因組測序完成,對(duì)于大量未知基因的功能研究已成為當(dāng)前研究的

11、熱點(diǎn)。利用基因敲除技術(shù)從整體動(dòng)物水平研究基因功能、人類疾病發(fā)病機(jī)制和新藥作用靶點(diǎn)已成為現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域最常用的技術(shù)手段之一。小鼠AU021092基因定位于小鼠基因組16號(hào)染色體,基因全長10478 bp,僅有唯一轉(zhuǎn)錄本,由8個(gè)外顯子組成,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為1375 bp,蛋白編碼產(chǎn)物為385個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析該基因進(jìn)化上高度保守,與人的同源性達(dá)71％。蛋白結(jié)構(gòu)分析預(yù)測AU021092為分泌蛋白,其N端存在20個(gè)氨基酸信號(hào)肽序列,C端存在4個(gè)