硒結(jié)合蛋白1生物功能及抗腫瘤作用機(jī)理的研究.pdf

1、硒做為一種人體必須的微量元素對(duì)于人體各種機(jī)能的提高和多種疾病的預(yù)防和治療都具有潛在的重要價(jià)值，長期較低的硒攝入量對(duì)人體健康具有多種不利的影響。由于我國約有70％的土地處在全球的缺硒帶上，其上產(chǎn)出的各種動(dòng)、植物和微生物產(chǎn)品都屬于缺硒產(chǎn)品，而無機(jī)硒的攝入又會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生多種毒副作用，因此硒蛋白做為一種有機(jī)硒的代表成為各種富硒食品和硒相關(guān)藥品研究的熱點(diǎn)。然而硒蛋白的生物功能多樣，作用靶點(diǎn)廣泛，具體抗病機(jī)制尚不清楚，阻礙了其在醫(yī)藥和食品中的進(jìn)一步

2、應(yīng)用，因此對(duì)硒蛋白結(jié)構(gòu)和功能以及抗病分子機(jī)制的研究具有重要意義。
　　硒結(jié)合蛋白1(SBP1)做為一種新型的含硒蛋白可能參與了人體細(xì)胞高爾基體蛋白運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)重要的生化進(jìn)程，并通過與多種其它蛋白的相互作用影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮其潛在的抑癌功能。本研究旨在通過蛋白組學(xué)的方法對(duì)SBP1的生物功能進(jìn)行研究揭示其參與癌癥發(fā)生的具體信號(hào)通路和分子機(jī)制，并通過SBP1與谷胱甘肽過氧化物酶(GPx1)的相互作用研究以及兩者與硒的協(xié)同作用揭示新的

3、腫瘤發(fā)病機(jī)制，進(jìn)一步了解SBP1的結(jié)構(gòu)，并為硒所介導(dǎo)的個(gè)性化腫瘤預(yù)防提供重要的理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果分述如下:
　　1.研究了SBP1在體內(nèi)和體外對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　利用誘導(dǎo)型病毒載體pRetroX-Tight-Pur構(gòu)建了SBP1哺乳動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)質(zhì)粒pRetroX-Tight-Pur-SBP1，并通過單克隆篩選得到了SBP1穩(wěn)轉(zhuǎn)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116-TetSBP1。使用該細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下大量誘導(dǎo)SBP

4、1蛋白的表達(dá)，并測定腫瘤細(xì)胞各種生物學(xué)行為的變化。通過對(duì)細(xì)胞增殖，細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡的檢測發(fā)現(xiàn)SBP1的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移影響不大，能夠誘導(dǎo)部分細(xì)胞發(fā)生凋亡但效果不顯著。將誘導(dǎo)SBP1表達(dá)的HCT116-TetSBP1細(xì)胞注射到裸鼠體內(nèi)，并在體內(nèi)維持SBP1的誘導(dǎo)表達(dá)，檢測其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)誘導(dǎo)SBP1表達(dá)不僅顯著抑制了腫瘤細(xì)胞在裸鼠皮下的生長而且顯著減少了腫瘤細(xì)胞向肺部的轉(zhuǎn)移。
　　2.利

5、用iTRAQ蛋白組學(xué)的方法研究了SBP1的體內(nèi)抑癌功能
　　從裸鼠皮下種植瘤形成的腫瘤組織中提取蛋白，使用iTRAQ蛋白組學(xué)的方法鑒定差異表達(dá)的蛋白，結(jié)果共鑒定到1975個(gè)蛋白，其中差異顯著蛋白132個(gè)(p＜0.05）。通過生物信息學(xué)GO生物功能分析和KEGG信號(hào)通路分析，篩選到了13個(gè)細(xì)胞脂代謝相關(guān)蛋白，其中5個(gè)為表達(dá)上調(diào)蛋白包括DKK1，HSP60，DHCR7，ANXA4和 AGPAT5;8個(gè)為表達(dá)下調(diào)蛋白包括LPCAT2，G

6、Px5，GAPDH，NME2，ALDH2，BPIFA3，PPIA和FABP4。另外篩選到7個(gè)細(xì)胞糖代謝相關(guān)蛋白包括GAA，GAPDH，ALDH2，TXN，ENO3，UGDH和LUM，全部為表達(dá)下調(diào)蛋白。對(duì)iTRAQ實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了Westernblotting驗(yàn)證，顯示iTRAQ分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
　　通過檢測多種信號(hào)通路蛋白表達(dá)的變化，表明SBP1對(duì)細(xì)胞脂代謝和糖代謝以及癌癥相關(guān)的多重信號(hào)通路都有影響。由此推測SBP1通過影響細(xì)胞

7、糖代謝和脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)參與了細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo)，包括EMT通路、WNT信號(hào)通路、JNK信號(hào)通路、NOTCH信號(hào)通路和NFkB信號(hào)通路，并通過這些癌癥相關(guān)信號(hào)通路引起一系列下游蛋白的激活或抑制，從而發(fā)揮其抑癌功能。
　　3.研究了SBP1硒結(jié)合位點(diǎn)對(duì)其功能的影響
　　對(duì)SBP1硒結(jié)合位點(diǎn)第57位氨基酸進(jìn)行了單核苷酸突變，使其密碼子由TGC突變?yōu)镚GC，編碼的氨基酸由半胱氨酸(Cys，C)突變?yōu)楦拾彼?Gly,G

8、)，去除了原有氨基酸上的一個(gè)巰基，使得SBP1失去了結(jié)合硒的能力，而對(duì)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不會(huì)產(chǎn)生太大的影響。構(gòu)建了突變SBP1哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-SBP1C57G，將其轉(zhuǎn)入人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116檢測對(duì)SBP1功能的影響。結(jié)果顯示:(1)硒造成的細(xì)胞毒性在有SBP1表達(dá)的細(xì)胞中導(dǎo)致的死亡率為38.2％，而在SBP1C57G表達(dá)的細(xì)胞中導(dǎo)致的死亡率為64.4％，因此SBP1C57G的點(diǎn)突變顯著降低了SBP1對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用;(2)

9、通過不同MCF7細(xì)胞中SBP1半衰期的檢測，表明兩種不同多態(tài)性的GPx1蛋白(GPx1A5P和GPx1A7L)的存在都會(huì)將SBP1蛋白的半衰期從45h延長到60h左右，而SBP1C57G的半衰期在GPx1存在時(shí)依然會(huì)從60h減少到45h，表明SBP1硒結(jié)合位點(diǎn)的突變破壞了這兩種蛋白之間的結(jié)合;(3)通過多個(gè)信號(hào)通路蛋白和細(xì)胞內(nèi)ATP含量的檢測，表明SBP1C57G引起了細(xì)胞ATP總含量的降低，進(jìn)而導(dǎo)致不依賴于信號(hào)通路的多個(gè)蛋白磷酸化的減

10、少。
　　4.研究了SBP1和GPx1兩種蛋白在體外的相互作用
　　構(gòu)建了大腸桿菌重組表達(dá)載體pQE80L-SBP1和pQE80L-GPx1，并利用大腸桿菌表達(dá)宿主SoluBL21實(shí)現(xiàn)了SBP1的可溶性表達(dá)。通過鎳柱純化和分子篩純化方法分別得到了電泳純的SBP1蛋白和GPx1蛋白。利用兩種純化蛋白在體外進(jìn)行相互作用后，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Superdex200凝膠層析的洗脫時(shí)間從原有的34 min(SBP1)和30 min(GPx1)分