胸腺素α1的生物合成及抗腫瘤機(jī)理研究.pdf

1、人胸腺素α1(Tα1)是一種28個氨基酸組成的具有免疫增強(qiáng)作用的生物活性多肽，其具有廣泛的生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等。目前Tα1被廣泛應(yīng)用于慢性病毒性肝炎、細(xì)菌或真菌感染、免疫缺陷以及腫瘤等疾病的治療，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益與社會價值，因此Tα1的功能研究與生產(chǎn)制備的探索都具有重要意義。本文將Tα1基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)并進(jìn)行化學(xué)修飾，同時研究其對腫瘤細(xì)胞的周期阻滯作用。
　　 本實驗首先以實驗室保存的核酸

2、片段為模板，人工合成了Tα1的核酸序列，將其與pTWINⅠ質(zhì)粒中的內(nèi)含肽自剪切序列(Ssp)相連，通過EcoRⅠ與XhoⅠ雙酶切與pET-32a質(zhì)粒連接，成功構(gòu)建了大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a-Ssp-Tα1，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株從而獲得有效表達(dá)(目的蛋白占總蛋白50％以上)。我們通過一系列實驗確認(rèn)目的蛋白主要以可溶形式存在于菌體內(nèi)，優(yōu)化了表達(dá)條件(37℃，IPTG終濃度0.5 mM)，并通過細(xì)胞破碎、收集離心上清、分

3、子篩層析與Ni+親和層析等過程純化了重組蛋白。然后改變環(huán)境pH以誘導(dǎo)融合蛋白發(fā)生內(nèi)切割，收集得到了N端無乙酰的Tα1單體，酸性環(huán)境下(pH3-4)使用醋酸酐對其進(jìn)行體外乙?；瘡亩玫搅送暾Y(jié)構(gòu)的Tα1多肽，并對其進(jìn)行HPLC純化與質(zhì)譜分析，驗證了其分子量(3108 Da)。另外本實驗通過western-blot，研究了Tα1作用下HepG-2細(xì)胞內(nèi)部分細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)Tα1能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Akt信號通路的阻滯和p5

4、3通路的激活，在降低cyclins與CDKs的表達(dá)水平的同時促進(jìn)CDKI的表達(dá)，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期于G1期。
　　 本實驗在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中有效表達(dá)Tα1融合蛋白后，又通過內(nèi)含肽誘導(dǎo)的蛋白自剪切技術(shù)得到Tα1單體，簡化了Tα1的生產(chǎn)工藝并有望降低其成本，為大量生產(chǎn)Tα1滿足臨床需求開辟了新途徑。同時發(fā)現(xiàn)Tα1能通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)水平來阻滯腫瘤細(xì)胞的生長周期，為進(jìn)一步研究Tα1的生物功能提供了新的思路，也為Tα1臨床應(yīng)