桑樹扦插生根的轉(zhuǎn)錄組分析及MaSAUR2和MaHO-1基因的表達分析.pdf

1、本試驗應(yīng)用Sole xa測序技術(shù)對桑樹兩種扦插方式生根發(fā)育過程插穗基部皮層進行轉(zhuǎn)錄組測序及生物信息學(xué)分析，并對在扦插生根過程中顯著差異表達的基因MaSAUR2與MaHO-1進行了基因克隆、序列特征分析以及表達特征分析。
　　主要實驗結(jié)果與結(jié)論如下：
　　1、根據(jù)插穗發(fā)育情況，采用夏秋季綠枝與秋末冬初綠枝扦插生根過程基部皮層材料構(gòu)建了7個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫：其中夏秋季綠枝扦插生根過程3個，分別為W1（對照未處理）、W2（基部膨大期）

2、、W3（不定根長出皮層期）；秋末冬初綠枝扦插生根過程4個，分別為Q1（對照未處理）、Q2（基部膨大期）、Q3（發(fā)育停滯期）、Q4（不定根長出皮層期）。經(jīng)過預(yù)處理，7個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得的高質(zhì)量read s條數(shù)為52,756,096-88,216,727條。對其進行蛋白功能注釋，結(jié)果7個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫注釋上的序列數(shù)分別為23837-39504，注釋率為35.81％-57.20%。根據(jù)contigs與蛋白功能注釋的對應(yīng)關(guān)系，將桑樹兩種綠枝扦插生

3、根發(fā)育過程中對應(yīng)發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行交叉分析，其中將數(shù)據(jù)庫W1與Q1、W2與Q2、W2與Q3、W3與Q4進行分析，獲得兩兩共同擁有的基因，并分別將其命名為A、B、C、D數(shù)據(jù)庫。結(jié)果得到數(shù)據(jù)庫A中有14191個UniProt注釋；B中有14142個UniProt注釋；C中有13760個UniProt注釋；D中有12355個UniP rot注釋。數(shù)據(jù)庫A與B差異基因篩選得到77個差異基因，B與C篩選得到1752個差異基因，C與D篩選得到

4、1991個差異基因，并對差異基因進行GO與KEGG功能富集聚類。根據(jù)功能富集結(jié)果，對各個發(fā)育階段的差異基因進行詳細分析，得出差異基因富集最多的通路主要為能量代謝、糖代謝、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞周期、生物的降解與合成等。
　　2、本試驗從桑樹莖部皮層中克隆得到一條SAUR（Small auxin-up RNA）基因的cDNA序列，將其命名為 MaSAUR2（GenBank登錄號：KC852881）。序列分析顯示該基因編碼182個氨基酸殘

5、基，所編碼蛋白的分子質(zhì)量約為20.7kDa，理論等電點pI約為9.39，有1個SAUR-specific domain（SSD）。熒光實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)根是MaSAUR2基因轉(zhuǎn)錄最活躍的組織，在莖和葉中表達量也相對較高，在芽中表達量相對較少，在熟果中沒有表達。應(yīng)用IAA溶液處理桑樹插穗，結(jié)果顯示插穗莖部皮層中的MaSAUR2基因在5min內(nèi)表達量迅速增加。在桑樹插穗不定根形成過程中，該基因在基部膨大期呈一個較低的表達水平，而在不定根

6、長出皮層期表達水平顯著升高，推測MaSAUR2在桑樹不定根的伸長生長過程中發(fā)揮了重要作用
　　3、從桑樹莖部皮層中克隆得到一條HO（heme oxygenase）基因的cDNA序列，將其命名為MaHO-1（GenBank登錄號：KJ544669）。序列分析顯示該基因編碼291個氨基酸殘基，所編碼的成熟蛋白分子量約為26.2kD，理論等電點pI約為8.79，有1個Hame oxygenase-like結(jié)構(gòu)域。熒光實時定量PCR檢測發(fā)

7、現(xiàn)MaHO-1轉(zhuǎn)錄最活躍的組織是葉，其次依次是芽、莖、熟果、根。應(yīng)用IAA溶液處理桑樹插穗，結(jié)果顯示插穗皮層的MaHO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平逐步上升，到6h表達量最大，之后表達量變化趨于平緩。在桑樹插穗不定根形成過程中，該基因維持一個較高的表達水平：從未處理到基部膨大期，表達量上升了5倍，之后表達量上升減緩。酶活性變化與基因表達量變化基本一致。并且MaHO-1表達量的上升發(fā)生在不定根形成之前。推測MaHO-1的上調(diào)表達在不定根的形成過程中發(fā)