白木香原生質體瞬時表達體系與植物MiRNA功能瞬時驗證體系的建立.pdf

1、本研究首先利用白木香莖段及幼葉誘導白木香愈傷組織，然后分別處理了白木香愈傷與葉片，通過改變酶液濃度、組織的量、材料處理方式、酶解時間等因素探索并構建了一個有效的白木香原生質體游離體系。然后從白木香愈傷組織中提取總RNA，采用特異引物RT-PCR方法克隆倍半萜合酶ASS基因，并連接于pEZS-NL載體和pFGC5941GFP改造載體上，分別構建pFGC5941-GFP-ASS、pEZS-NL-ASS-GFP兩種植物表達載體，分別利用PEG

2、轉化白木香原生質體、農(nóng)桿菌侵染煙草葉片、基因槍轟擊洋蔥表皮細胞三種技術進行瞬時轉化表達，激光共聚焦顯微鏡下觀察表達出的綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白的表達并比較三種方法不同的表達情況。研究結果表明，將ASS導入白木香原生質體、煙草葉片表皮細胞及洋蔥表皮細胞中，融合蛋白綠色熒光均能被觀察到，但其在三種體系中的表達量不同，在煙草表皮細胞中的表達量最高。與此同時融合蛋白在白木香原生質體的胞質及質體定位較清晰，白木香倍半萜合酶ASS在胞質及質體

3、定位，與其他植物中倍半萜合酶亞細胞定位的推測及研究相符。
　　研究中還選用雙元表達載體pCAMBIA1200（插入煙草花葉病毒雙35S啟動子驅動）與pFGC5941GFP改造載體分別用于miRNA和潛在的靶基因與綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白的農(nóng)桿菌瞬時表達，通過觀察GFP融合蛋白的熒光，驗證miRNA對潛在靶基因表達的影響。為驗證這一體系的有效性，選取擬南芥已知功能的miR393及其可以抑制的靶基因AFB3，分別構建pCAMBI

4、A1200-35 S-miR393載體和pFGC5941-GFP-AFB3載體。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)瞬時轉化的三種方法中，農(nóng)桿菌侵染煙草葉片法的效率最高，因此利用該技術進行pCAMBIA1200-35 S-miR393、pFGC5941-GFP-AFB3兩個載體共轉和pFGC5941-GFP-AFB3單轉的瞬時轉化，激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的表達。只將AFB3導入煙草表皮細胞，可觀察到綠色熒光;而將miR393與AFB3同時導入煙草

5、表皮細胞后，未能觀察到綠色熒光。表明miR393抑制了AFB3的表達。因此，基于農(nóng)桿菌注射法的煙草（Nicotiana tabacum）瞬時表達體系能夠作為植物miRNA功能的活體瞬時驗證體系，為miRNA調(diào)控靶基因表達功能提供簡單、快速、有效的證據(jù)，為今后研究藥用植物中其它miRNA與其靶基因提供了簡便可靠的體系。
　　本研究成功構建白木香葉片和愈傷原生質體游離體系，并實現(xiàn)了目標基因在白木香愈傷原生質體的PEG瞬時轉化與表達;進