用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)蛋白提高煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化率的研究.pdf

1、本項(xiàng)研究旨在利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA轉(zhuǎn)移過程中三個(gè)協(xié)助轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性基因：VirD1，VirD2，VirE2來協(xié)助綠色熒光蛋白基因GFP轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體，為將來結(jié)合花粉管通道法轉(zhuǎn)化其他植物，探索出一條轉(zhuǎn)化效率高、不受宿主限制和再生系統(tǒng)限制的轉(zhuǎn)化途徑打下基礎(chǔ)，給植物轉(zhuǎn)基因工作在科研和技術(shù)上帶來極大方便。 本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了一對分別含BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的引物，利用PCR技術(shù)，克隆了C58根癌土壤農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒毒性區(qū)蛋白VirD1基

2、因，并將VirD1、GFP基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET30a上，同時(shí)獲得了原核表達(dá)蛋白。構(gòu)建了瞬時(shí)表達(dá)載體pUC-pBin，并將目的基因VirD1，VirD2，VirE2和GFP分別連在瞬時(shí)表達(dá)載體上。建立了煙草原生質(zhì)體穩(wěn)定培養(yǎng)體系，在含GFP基因的質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體的處理中，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化率最低，在0.3％左右；在含VirD1、VirD2、VirE2基因的質(zhì)粒分別介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化中，轉(zhuǎn)化率與對照相比有不同程度的提高，其中含VirD2、V