固定化原生質體轉化合成L-半胱氨酸的研究.pdf

1、L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料工業(yè)。本試驗篩選獲得一株假單胞菌SDN625，可轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸。本研究從SDN625菌株的原生質體制備和誘變篩選、原生質體固定化、酶法連續(xù)轉化、L-半胱氨酸產物的分離純化、分析方法研究、產物鑒定等方面進行了研究，研究結果如下：
　　 從山東新時代藥業(yè)有限公司污水處理中心的活性污泥中篩選到一株可轉化DL-ATC合成L-半胱氨酸的菌株，命名為S

2、DN625，培養(yǎng)48 h后的細胞合成L-半胱氨酸的酶活可以達到3443 U/mL。將培養(yǎng)18 h的細胞收集后加入終濃度為2mg/mL的溶菌酶，在37℃酶解1 h，原生質體形成率可以達到87.3％，形成的原生質體加入濃度為50μg/mL誘變劑NTG，28℃輕微振蕩30min后經過再生和篩選，篩選出一株合成L-半胱氨酸的酶活可達到4492 U/mL的菌株，比原始菌株SDN625酶活最高值提高30.5％，命名為SDN625-1。
　　

3、 使用海藻酸鈣和聚丙烯酰胺兩種固定化方式對菌株SDN625-1的原生質體固定化，結果發(fā)現(xiàn)海藻酸鈣固定化明顯優(yōu)于聚丙烯酰胺。利用海藻酸鈣進行固定化時，培養(yǎng)28 h收獲細胞，加入終濃度為2 mg/mL的溶菌酶，37℃保溫4 h，固定化粒子的細胞密度調節(jié)為1×108個/mL，凝膠粒子直徑2 mm時固定化效果最佳。對最優(yōu)的酶促反應條件進行考察發(fā)現(xiàn)，反應的底物溶液中的DL-ATC濃度為0.8％、反應溫度40℃、pH值為8.0時，可以得到最大的底物

4、轉化率。
　　 通過比較，固定化原生質體與固定化細胞具有同樣的反復使用性能，均可以反復使用3次以上。經過20天4℃的低溫冷藏，然后加入新鮮的產酶培養(yǎng)基進行酶活力復蘇培養(yǎng)，原生質體在培養(yǎng)24 h左右可恢復酶活力90％以上。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖高滲液是比較合適的固定化原生質體貯藏液。結果還發(fā)現(xiàn)固定化原生質體比固定化完整細胞在前3次使用時的轉化率都高15％左右。
　　 設計了柱式流化床反應器連續(xù)轉化生成L-半胱氨酸技術路線。在最佳條

5、件下制備原生質體固定化粒子，裝柱后配制底物溶液進行最適條件下的連續(xù)轉化反應，轉化16 h后收集到含有產物濃度為5.04 mg/mL的溶液4900 mL，摩爾轉化率為75.7％。使用Dowex50W×2 H+型陽離子交換樹脂對產物進行了純化，得到L-半胱氨酸產物結晶19.6 g，純化收率79.4％。結晶后的產物經比旋光度、DTNB對巰基的特異性反應、Rf值以及高效液相色譜進行檢測后定性為L-半胱氨酸。
　　 對L-半胱氨酸的高效液