固定化原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化合成L-半胱氨酸的研究.pdf

1、L-半胱氨酸是一種重要的含硫氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品以及飼料工業(yè)。本試驗(yàn)篩選獲得一株假單胞菌SDN625，可轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸。本研究從SDN625菌株的原生質(zhì)體制備和誘變篩選、原生質(zhì)體固定化、酶法連續(xù)轉(zhuǎn)化、L-半胱氨酸產(chǎn)物的分離純化、分析方法研究、產(chǎn)物鑒定等方面進(jìn)行了研究，研究結(jié)果如下：
　　 從山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司污水處理中心的活性污泥中篩選到一株可轉(zhuǎn)化DL-ATC合成L-半胱氨酸的菌株，命名為S

2、DN625，培養(yǎng)48 h后的細(xì)胞合成L-半胱氨酸的酶活可以達(dá)到3443 U/mL。將培養(yǎng)18 h的細(xì)胞收集后加入終濃度為2mg/mL的溶菌酶，在37℃酶解1 h，原生質(zhì)體形成率可以達(dá)到87.3％，形成的原生質(zhì)體加入濃度為50μg/mL誘變劑NTG，28℃輕微振蕩30min后經(jīng)過(guò)再生和篩選，篩選出一株合成L-半胱氨酸的酶活可達(dá)到4492 U/mL的菌株，比原始菌株SDN625酶活最高值提高30.5％，命名為SDN625-1。
　　

3、 使用海藻酸鈣和聚丙烯酰胺兩種固定化方式對(duì)菌株SDN625-1的原生質(zhì)體固定化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海藻酸鈣固定化明顯優(yōu)于聚丙烯酰胺。利用海藻酸鈣進(jìn)行固定化時(shí)，培養(yǎng)28 h收獲細(xì)胞，加入終濃度為2 mg/mL的溶菌酶，37℃保溫4 h，固定化粒子的細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為1×108個(gè)/mL，凝膠粒子直徑2 mm時(shí)固定化效果最佳。對(duì)最優(yōu)的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)的底物溶液中的DL-ATC濃度為0.8％、反應(yīng)溫度40℃、pH值為8.0時(shí)，可以得到最大的底物

4、轉(zhuǎn)化率。
　　 通過(guò)比較，固定化原生質(zhì)體與固定化細(xì)胞具有同樣的反復(fù)使用性能，均可以反復(fù)使用3次以上。經(jīng)過(guò)20天4℃的低溫冷藏，然后加入新鮮的產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行酶活力復(fù)蘇培養(yǎng)，原生質(zhì)體在培養(yǎng)24 h左右可恢復(fù)酶活力90％以上。研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖高滲液是比較合適的固定化原生質(zhì)體貯藏液。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)固定化原生質(zhì)體比固定化完整細(xì)胞在前3次使用時(shí)的轉(zhuǎn)化率都高15％左右。
　　 設(shè)計(jì)了柱式流化床反應(yīng)器連續(xù)轉(zhuǎn)化生成L-半胱氨酸技術(shù)路線(xiàn)。在最佳條

5、件下制備原生質(zhì)體固定化粒子，裝柱后配制底物溶液進(jìn)行最適條件下的連續(xù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化16 h后收集到含有產(chǎn)物濃度為5.04 mg/mL的溶液4900 mL，摩爾轉(zhuǎn)化率為75.7％。使用Dowex50W×2 H+型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行了純化，得到L-半胱氨酸產(chǎn)物結(jié)晶19.6 g，純化收率79.4％。結(jié)晶后的產(chǎn)物經(jīng)比旋光度、DTNB對(duì)巰基的特異性反應(yīng)、Rf值以及高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)后定性為L(zhǎng)-半胱氨酸。
　　 對(duì)L-半胱氨酸的高效液