L-半胱氨酸對(duì)細(xì)菌產(chǎn)氫過(guò)程的促進(jìn)作用.pdf

1、有機(jī)廢水發(fā)酵法生物制氫技術(shù)以其環(huán)境友好并產(chǎn)生清潔能源的特點(diǎn)，逐漸成為環(huán)境生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，隨著不同種屬的產(chǎn)氫細(xì)菌被分離純化、不同形式的制氫反應(yīng)器被研發(fā)、產(chǎn)氫細(xì)菌的培養(yǎng)條件得到優(yōu)化以及分子生物學(xué)技術(shù)的引入，發(fā)酵法生物制氫技術(shù)理論逐漸得到發(fā)展完善。生產(chǎn)性示范工程的調(diào)試和運(yùn)行更是為生物制氫技術(shù)的推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。然而如何提高產(chǎn)氫效率、降低生產(chǎn)成本、穩(wěn)定運(yùn)行反應(yīng)器仍是該技術(shù)工業(yè)化得到應(yīng)用需要解決的問(wèn)題。一直以來(lái)，研究人員嘗試采

2、用各種方法提高產(chǎn)氫效率。本研究選擇L-半胱氨酸作為產(chǎn)氫促進(jìn)劑，一方面因?yàn)?L-半胱氨酸是一種良好的還原劑；另一方面 L-半胱氨酸具有巰基，而巰基是氫化酶的官能團(tuán)之一。因此，研究L-半胱氨酸促進(jìn)產(chǎn)氫細(xì)菌的生長(zhǎng)、產(chǎn)氣、代謝以及作用機(jī)制，對(duì)于提高細(xì)菌的產(chǎn)氫能力有重要的意義，對(duì)于研究其它提高產(chǎn)氫速率的方法具有借鑒作用，同時(shí)對(duì)于深化產(chǎn)氫理論有一定的參考價(jià)值。
　　針對(duì) L-半胱氨酸對(duì)于產(chǎn)氫細(xì)菌的影響，本文從細(xì)菌純培養(yǎng)、混合培養(yǎng)等角度進(jìn)行研究

3、，通過(guò)分批培養(yǎng)、連續(xù)流培養(yǎng)等手段考察 L-半胱氨酸對(duì)細(xì)菌產(chǎn)氫效能的促進(jìn)作用。同時(shí)利用Real-Time PCR技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了氫化酶表達(dá)的定量檢測(cè)，更加準(zhǔn)確的描述了 L-半胱氨酸的促氫作用機(jī)制，也為其他產(chǎn)氫細(xì)菌靶基因的定量表達(dá)方法提供參考。
　　選擇乙醇型發(fā)酵中優(yōu)勢(shì)種群的模式菌株產(chǎn)乙醇桿菌 YUAN-3進(jìn)行考察，優(yōu)化了 YUAN-3的生長(zhǎng)條件，在含有緩沖體系的培養(yǎng)基初始 pH為6.0時(shí)，YUAN-3的平均產(chǎn)氫速率和比產(chǎn)氫率都達(dá)到最大，

4、分別為5.75 mmolH2/g-CDW·h和2.32 molH2/mol-葡萄糖。在初始pH7.0時(shí)，細(xì)胞干重達(dá)到最大，為0.59g/L-培養(yǎng)基。
　　對(duì)于產(chǎn)氫細(xì)菌 YUAN-3的分批培養(yǎng)顯示適量添加 L-半胱氨酸可以促進(jìn)發(fā)酵細(xì)菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)氫，并提高底物利用能力。細(xì)胞干重隨著 L-半胱氨酸濃度的增加而增加，當(dāng)L-半胱氨酸濃度為1.5g/L時(shí)，生物量達(dá)到最大為0.53g/L-培養(yǎng)基，產(chǎn)生的氫氣量在 L-半胱氨酸為0.8g/L時(shí)達(dá)到

5、最大值為1995 mL/L-培養(yǎng)基。實(shí)測(cè)數(shù)值和用matlab模擬修正的Gompertz方程證明了L-半胱氨酸的添加加速了YUAN-3的產(chǎn)氣過(guò)程。
　　L-半胱氨酸的流加迅速降低了反應(yīng)器內(nèi)部的ORP，促進(jìn)了乙醇型發(fā)酵的形成，提高了產(chǎn)氫速率、生物量，并提高了微生物產(chǎn)氫活性。流加 L-半胱氨酸的反應(yīng)器在14d后開(kāi)始形成逐漸典型的代謝產(chǎn)物，此后其優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯。未流加 L-半胱氨酸反應(yīng)器在啟動(dòng)20d以后才形成以乙酸、乙醇為主要代謝產(chǎn)物的乙

6、醇型發(fā)酵。在啟動(dòng)的第1d，流加L-半胱氨酸的反應(yīng)器的ORP就立即下降到-400mv左右，而未流加 L-半胱氨酸的反應(yīng)器內(nèi)的ORP下降至此需要10d以上。在啟動(dòng)結(jié)束時(shí)，未流加和流加 L-半胱氨酸的反應(yīng)器平均產(chǎn)氫速率分別為2.74 L/d和2.81 L/d，生物量分別為為9.5g/L和10.1g/L。
　　從細(xì)胞水平和分子水平分別考察 L-半胱氨酸促進(jìn)產(chǎn)氫作用機(jī)制。結(jié)果表明，L-半胱氨酸在促進(jìn) YUAN-3產(chǎn)氫過(guò)程中促進(jìn)了碳源的利用，

7、并發(fā)揮了還原劑的作用，同時(shí)還促進(jìn)了 YUAN-3的凝集能力，但L-半胱氨酸不能緩解產(chǎn)物的反饋抑制。用特異引物對(duì)氫化酶表達(dá)進(jìn)行定量分析，擴(kuò)增結(jié)果表明，添加L-半胱氨酸后，氫化酶基因表達(dá)增強(qiáng)，在 L-半胱氨酸的濃度為0.8 g/L-培養(yǎng)基時(shí)，氫化酶基因表達(dá)可達(dá)2.72×107拷貝數(shù)/μL。L-半胱氨酸的添加使等蛋白情況下乙醇脫氫酶的活性減弱，但由于生物量的增加和單位生物量產(chǎn)生蛋白質(zhì)濃度的增加，添加 L-半胱氨酸后乙醇的產(chǎn)量仍逐漸增加。綜上分