原生質(zhì)體的分離與融合

1、原生質(zhì)體的分離與融合,,什么是原生質(zhì)體,原生質(zhì)體，是指出去細胞壁的植物細胞的部分。由Hanstein 1980年提出在適當(dāng)條件下，原生質(zhì)體可以成功培養(yǎng)長出細胞壁，并通過細胞分裂。原生質(zhì)體不僅對細胞融合研究有價值，且能通過裸露的質(zhì)膜獲得外源DNA、細胞器、細菌和病毒顆粒等。,一、原生質(zhì)體分離,原生質(zhì)體分離的基本原則是 保證原生質(zhì)體不受傷害并不損害其再生能力。1. 機械法 只有儲藏組織中較大的、

2、高度液泡化的細胞才能用于分離原生質(zhì)體，如洋蔥球莖鱗片、蘿卜根、甜菜根等； 缺點：產(chǎn)量低；方法枯燥無力；因破碎細胞釋放物的存在，原生質(zhì)體活力低。2. 酶法 Cocking 在1960年證實了可用酶分離原生質(zhì)體。Takabe等1968年首次用商業(yè)酶試劑分離原生質(zhì)體，并在1971年獲得再生植株。缺點是：不純酶制劑所含的雜質(zhì)可能會對原生質(zhì)體產(chǎn)生不同程度的毒害作用。,原生質(zhì)體的分離,二、影響原生質(zhì)體分離的

3、因素,原生質(zhì)體分離時主要考慮取材、酶的種類、純度、酶液的滲透壓、酶解時間、溫度等。1 組織和細胞材料的生理狀態(tài) 植物幼苗或新生枝的完全伸展葉片的葉肉組織是分離原生質(zhì)體的最方便、最合適的植物材料。葉肉細胞排列松散，酶試劑很容易達到細胞壁。用于分離原生質(zhì)體的愈傷組織或懸浮細胞應(yīng)當(dāng)處于生長早期或指數(shù)生長期。 采用愈傷組織或懸浮細胞，采用其材料可以避免植株生長環(huán)境的不良影響，可以常年供應(yīng)，易于控制新生細胞的年齡，處理

4、時操作方便，無需消毒。,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,2 酶纖維素和半纖維素是細胞壁的初生結(jié)構(gòu)和次生結(jié)構(gòu)的成分，果膠類物質(zhì)是連接細胞胞間層的成分。纖維素酶（降解構(gòu)成細胞壁的纖維素）、半纖維素酶、果膠酶（使細胞從組織中分開，以及細胞與細胞分開）酶活性與pH有關(guān)，4.7~6.0，溫度一般在25~30℃,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,3 滲透劑 原生質(zhì)體直接釋放到培養(yǎng)基中會破裂，因此，在分離原生質(zhì)體期間，須對原來細胞壁機械維持壓

5、力用原生質(zhì)體分離混合液以及后來培養(yǎng)基的適當(dāng)滲透壓代替。在合適的滲透壓溶液中，剛分離的原生質(zhì)體看起來是球狀的。,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,4 原生質(zhì)體的純化 酶消化后得到的混合物含有亞細胞碎片、未消化的細胞、破碎的和完整的原生質(zhì)體?？赏ㄟ^對此混合物通過過濾、離心、漂洗聯(lián)合的方法進行純化。1） 收集：原生質(zhì)體混合液用濾網(wǎng)（40~100μm）去掉沒有降解的細胞及組織，收集濾液。2）洗滌：將網(wǎng)下物低速離心，去掉上清液，再加無酶

6、液的CPW液懸起起原生質(zhì)體，再離心，棄上清，重復(fù)幾次即可。,,3）純化（上浮法和下沉法）上浮法是將酶解的原生質(zhì)體與蔗糖溶液（23%左右）混合。下沉法是講原生質(zhì)體與13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液頂部，形成一個界面。兩種方法中，均在離心5~10分鐘后，在蔗糖溶液頂部形成一條原生質(zhì)體帶。用吸管將帶輕輕吸出來，懸浮離心，稀釋后用于培養(yǎng)。,二、影響原生質(zhì)體分離的因素,5 原生質(zhì)體的活力測定和密度 原生質(zhì)體的真正活力使

7、原生質(zhì)體有能力通過持續(xù)有絲分裂，再生成愈傷組織，并最終再生成植株。 測定原生質(zhì)體活力的方法主要有：FDA（熒光素二乙酸）染色法；酚藏紅花（CFW）染色法；測定呼吸強度法等。,影響原生質(zhì)體分離的因素,6 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基中應(yīng)當(dāng)去除銨，因為它對原生質(zhì)體的生存是有害的，而鐵、鋅的含量也應(yīng)當(dāng)減少。另外，鈣的濃度應(yīng)當(dāng)比通常培養(yǎng)細胞所需的 濃度增加2~4倍，提高鈣的濃度能改善膜的穩(wěn)定性。 葡萄糖是最好最可靠的

8、碳源，其次為蔗糖。7 環(huán)境因子 一般來說，剛開始培養(yǎng)時高光強會抑制原生質(zhì)體的生長，因此應(yīng)先在黑暗或弱光下培養(yǎng)幾天，再將其轉(zhuǎn)移到一般光強下培養(yǎng)。溫度范圍20~28度適宜，pH范圍5.5~5.9適宜。,三、原生質(zhì)體培養(yǎng),原生質(zhì)體培養(yǎng)1. 液體淺層培養(yǎng)（Liquid thin layer culture）原生質(zhì)體純化后，將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基中，取少許于培養(yǎng)皿底部形成很薄的一層，封口培養(yǎng)。2. 固體培養(yǎng)（So

9、lid culture）也叫瓊脂糖平板法或包埋培養(yǎng)法。將原生質(zhì)體懸浮于液體培養(yǎng)基后，與凝固劑（瓊脂或瓊脂糖）按一定比例混合，在培養(yǎng)皿底部形成一薄層，凝固后封口培養(yǎng)。3. 固液雙層培養(yǎng)法（Solid over liquid culture）即先在培養(yǎng)皿底部鋪一層固體培養(yǎng)基，待凝固后再在其上進行液體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可以被液體層中的原生質(zhì)體吸收利用，而原生質(zhì)體產(chǎn)生的有毒物質(zhì)可以被固體培養(yǎng)基吸收。,細胞再生,（1

10、）細胞壁形成不同植物原生質(zhì)體再生細胞壁所需時間不一樣，從幾小時到幾天。原生質(zhì)體失去其圓球形特征表明了新細胞壁的再生。簡單鑒別壁再生的方法是用熒光增白劑（CFW）染色法檢測到。（2）細胞分裂第一次細胞分裂一般發(fā)生在2~7d內(nèi)，分裂活躍的細胞懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體與葉片高度分化細胞的原生質(zhì)體相比，前者進入第一次細胞分裂較快。（3）植株再生具有再生能力的原生質(zhì)體就會不斷分裂形成多細胞團。當(dāng)細胞團進一步發(fā)育成為肉眼可見的小愈傷組織，要

11、及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（Differentiation medium）中，培養(yǎng)與再生過程同一般的愈傷組織培養(yǎng)。,體細胞雜交,離體條件下，通過分離體細胞原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜合體，再通過其異核體的發(fā)育形成雜種植株的技術(shù)被稱為體細胞雜交。這個程序消除了雜交中性別因素。克服不親和性障礙，成為植物基因的遺傳操作方法。在體細胞雜交中，親本的細胞核和細胞質(zhì)在雜種細胞中融合了。有時，融合的雜合體中只有一個親本的核基因，而有兩個親本的細胞質(zhì)基

12、因，這樣的雜種叫胞質(zhì)雜種。,體細胞雜交,物種間生殖隔離阻礙了物種之間的基因交流，從而給作物育種帶來很大的局限性。原生質(zhì)體融合技術(shù)是實現(xiàn)基因重組的一條新途徑，目前利用細胞融合已從很多物種、屬間，甚至科間獲得體細胞雜種，創(chuàng)造了一些自然界不存在的植物類型。,,原生質(zhì)體融合技術(shù)體系大致包括三大環(huán)節(jié)：誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合選擇融合體或雜種細胞雜種植株的再生與鑒定,(一) 原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion）是指不同種

13、類的原生質(zhì)體不經(jīng)過有性階段，在一定條件下融合創(chuàng)造雜種的過程。1 自然融合（Spontaneous fusion） 來源于分裂旺盛細胞的原生質(zhì)體，自發(fā)融合的頻率較高。小孢子來源的原生質(zhì)體融合率可高達50~70%。實際上自然條件下受精就是一種自發(fā)融合。,(一) 原生質(zhì)體融合,2 誘發(fā)融合1) NaNO3處理法 Power 于1970年采用NaNO3溶液誘導(dǎo)燕麥與玉米根尖原生質(zhì)體融合，首次得到融合體。1972年，美國學(xué)

14、者Carlson等采用此法獲得郎氏煙草與粉藍 煙草體細胞雜種，這是植物中首例體細胞雜種。 缺點是Na+造成膜電位的改變。融合頻率低。2) 高pH-高鈣法 Keller和Melchers于1973年報道采用高濃度Ca2+的強堿溶液處理煙草葉肉原生質(zhì)體，可以使融合頻率大幅度增加，達到50%。之后，采用此方法成功獲得了煙草種間和屬間體細胞雜種。,,3)水溶性多聚體——聚乙二醇（PEG）法 最成功的原生質(zhì)體融合技術(shù)。

15、1976年Kao發(fā)現(xiàn)用含高濃度Ca2+的強堿溶液清洗PEG誘導(dǎo)和原生質(zhì)體時，融合頻率得到到進一步提高，因而發(fā)展起高pH-PEG法。PEG誘導(dǎo)小麥與玉米融合產(chǎn)生不育雜種,,,4)電融合法（Electrofusion）主要是雙向電泳法，其基本原理：與PEG融合比較起來，電融合有三大優(yōu)點：一是不存在對細胞的毒害問題；二是融合效率高；三是融合技術(shù)操作簡便。,,電融合的基本過程：細胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后

16、，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。,體細胞雜種的特點,形態(tài)上的趨中性 變異幅度大 非整倍性 雙親性狀的共顯性 偏親現(xiàn)象,雜種細胞的選擇系統(tǒng)與雜種植株的鑒定,1．雜種細胞的選擇系統(tǒng) 外觀選擇?

17、 互補選擇? 熒光標(biāo)記選擇,,2．體細胞雜種的鑒定任何兩個種的原生質(zhì)體都可以融合在一起。然而，高等植物體細胞雜交的廣泛利用收到一些限制，包括非整倍體、雜交的種障礙和不可能從原生質(zhì)體再生成植株等。雜種性的鑒定要求有證明兩個融合親本遺傳貢獻的清楚證據(jù)，而雜種性只能來源于整倍體，而不能來源于非整倍體。,,形態(tài)鑒定：根據(jù)雙親的形態(tài)學(xué)性狀觀察進行鑒定。雜種在形態(tài)上往往介于雙親之間，包括株型、葉形、花器官等,,細胞學(xué)鑒定：細胞器鑒定、染色

18、體鑒定。染色體計數(shù)：染色體數(shù)目是雙親之和，或少1至幾條染色體。所以，細胞融合可以創(chuàng)造非整倍體。代換系、染色體片段置換系等珍貴的遺傳學(xué)研究材料。這些遺傳材料對于基因定位、確定染色體與分子標(biāo)記連鎖群的關(guān)系、育種等有重要應(yīng)用價值。,,生化鑒定：同功酶鑒定分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標(biāo)記鑒定是最有效的檢測手段，尤其是細胞學(xué)無法確定是雜種的時候，分子標(biāo)記更有用，它能檢測出遺傳物質(zhì)的細小重組。,體細胞雜種的遺傳特性,1．細胞分裂與染色體丟

19、失 如果細胞分裂而核不發(fā)生融合，在以后的發(fā)育過程中就會有兩種結(jié)果，一是細胞分裂幾次以后即停止生長從而導(dǎo)致死亡；二是在發(fā)育過程中某一親本的細胞核部分或全部丟失。如果這樣就會產(chǎn)生幾種情況：A細胞＋B細胞質(zhì)；A細胞＋B細胞質(zhì)和部分染色體或基因。,體細胞雜種的遺傳特性,2．基因轉(zhuǎn)移與性狀表達 由于染色體的部分丟失，常常使某個親本的部分或個別基因與另一親本的染色體發(fā)生整合，其結(jié)果是實現(xiàn)了親本間的基因轉(zhuǎn)移?；蜣D(zhuǎn)移通常是在后代中某些

20、性狀得以表達，有時由于基因的重組也可能產(chǎn)生雙親均沒有的新性狀。 3．體細胞雜種遺傳上的不穩(wěn)定性 體細胞雜種后代在遺傳上常常不穩(wěn)定，這可能涉及到多方面的因素，如親緣關(guān)系的遠近、培養(yǎng)過程中的染色體變異、細胞核、細胞質(zhì)遺傳物質(zhì)的重組等。,體細胞雜種的應(yīng)用,一、體細胞雜種的應(yīng)用潛力1、 植物育種中的核質(zhì)替換2、 細胞質(zhì)雜種的獲得3、 遠緣雜交創(chuàng)造新物種4、 細胞器的互作研究,體細胞雜種的應(yīng)用,二、體細胞雜交面臨的困難1