灰棗的組織培養(yǎng)與葉片原生質(zhì)體的分離.pdf

1、本試驗(yàn)以灰棗為試材,從田間采樣建立組培體系,即啟動培養(yǎng)、繼代培養(yǎng),并以試管苗葉片為材料分離原生質(zhì)體,研究了材料預(yù)處理對原生質(zhì)體分離的影響、分離原生質(zhì)體的所需要的混合酶液種類及濃度、漂浮法收集原生質(zhì)體時蔗糖的濃度及離心速度、酶解時間以及滲透壓調(diào)節(jié)劑甘露醇的濃度,為以后利用原生質(zhì)體進(jìn)行灰棗的遺傳轉(zhuǎn)化和原生質(zhì)體融合,實(shí)現(xiàn)品種改良和創(chuàng)造新品種提供技術(shù)條件。主要試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.建立了灰棗組培體系,為進(jìn)行葉片原生質(zhì)體的分離奠定了基

2、礎(chǔ)。
　　 (1)大田采樣時,外植體滅菌較為困難,先以70％酒精滅菌30s,再以0.1％HgCl2滅菌10-15min后污染率依然高達(dá)97.8％,但該類污染最初發(fā)生在外植體下端切口處,隨著培養(yǎng)時間的延長,逐漸擴(kuò)大到培養(yǎng)基表面。培養(yǎng)基中添加150mg/L或200mg/L頭孢霉素可使污染率降為0；添加鏈霉素也能降低污染率,但對棗腋芽的萌發(fā)有抑制作用,而頭孢霉素對腋芽的萌發(fā)影響不明顯,因此,選擇頭孢霉素150mg/L為適宜的抗生素種類

3、和濃度。
　　 (2)灰棗啟動培養(yǎng)中,在培養(yǎng)基MS+KT2.0 mg/L+NAA0.1mg/L獲得的粗壯棗頭數(shù)量較多,細(xì)弱的二次枝和棗吊較少,為適宜的啟動培養(yǎng)基。
　　 (3)灰棗的繼代培養(yǎng)中,細(xì)胞分裂素KT適合壯苗,最適壯苗培養(yǎng)基為MS+KT2.0mg幾+NAA0.3mg/L,所獲得的棗苗長勢壯、葉片大、葉深綠,適宜作為進(jìn)一步研究的材料；6-BA適合增殖,最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.3 m

4、g/L,增殖系數(shù)最高,為2.7。
　　 2.建立了灰棗葉片原生質(zhì)體分離純化體系,獲得了產(chǎn)量高、活力高的原生質(zhì)體。
　　 (1)在酶解分離原生質(zhì)體前,以真空處理6min,酶解14h能夠獲得最高產(chǎn)量,比未經(jīng)真空處理酶解時間縮短2h,提高了酶解效率。
　　 (2)以繼代20天左右試管苗頂梢3片完全展開的嫩葉為分離材料,在2.0％Cellulase R-10+0.1％MacerozymeR-10+0.1％Pectolas

5、e Y-23+0.4％Driselase酶液中獲得原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,為1.1×107個/g·Fw,活力85.7％,并且在使用的4種酶中,對原生質(zhì)體分離影響大小順序?yàn)镈riselase>CellulaseR-10〉MacerozymeR-10>Pectolase Y-23,Driselase對原生質(zhì)體的分離起首要作用。
　　 (3)漂浮法收集原生質(zhì)體時,適宜的蔗糖濃度為1.5mol/L,離心速度為2300rpm,蔗糖濃度和離心速度