楊樹(shù)原生質(zhì)體分離及電融合技術(shù)體系的研究.pdf

1、本文以南林895楊(Populus×euramericana cv ‘Nanlin895’)、轉(zhuǎn)Bt基因南林895楊和銀白楊(P.alba)為材料，在建立懸浮細(xì)胞系及植株再生的基礎(chǔ)上，開(kāi)展楊樹(shù)原生質(zhì)體分離和電融合研究，篩選適合楊樹(shù)的原生質(zhì)體分離與純化、原生質(zhì)體電融合及雜種篩選和培養(yǎng)等條件、方法。旨在為楊樹(shù)體細(xì)胞雜交種質(zhì)創(chuàng)新研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下： 1．幼嫩莖段較適合誘導(dǎo)愈傷組織。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2，4-D2m

2、g/L。將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷繼代培養(yǎng)基：MS+2，4-D 2mg/L+KT 0/2mg/L，經(jīng)4～5次繼代培養(yǎng)后獲得淡黃色、結(jié)構(gòu)疏松的胚性愈傷組織，將其轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基：MS+2，4-D 2mg/L+NAA0.2mg/L+KT 0.1 mg/L+水解酪蛋白500mg/L，建立楊樹(shù)懸浮細(xì)胞系； 2．南林895楊和轉(zhuǎn)Bt基因南林895楊愈傷組織最適合芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5mg/L+IAA 0.5mg/L：芽增殖培養(yǎng)

3、基為：MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L；生根培養(yǎng)基為：1/2MS(大量元素減半)。銀白楊愈傷組織最適合芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.5mg/L+KT 0.5mg/L+TDZ0.002mg/L；芽增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA0.25mg/L+KT0.25mg/L+TDZ 0.001mg/L；生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IBA 0.2mg/L； 3．楊樹(shù)葉肉原生質(zhì)體分離的最佳條件為：酶液：纖維素酶(Cellula

4、se R-10)1％+纖維素酶(Cellulase RS)1％+果膠酶(Pectolyase Y-23)0.5％+甘露醇0.6mol/L，28℃，黑暗條件下54rpm輕搖振蕩酶解。南林895楊、轉(zhuǎn)Bt基因南林895楊葉片需酶解10h，而銀白楊葉片酶解時(shí)間為14h，可獲得純度及活力高的楊樹(shù)原生質(zhì)體； 4．楊樹(shù)懸浮細(xì)胞系原生質(zhì)體分離的最佳條件為：酶液：纖維素酶(Cellulase R-10)1％+纖維素酶(Cellulase RS)

5、1％+果膠酶(Pectolyase Y-23)0.3％+甘露醇0.7mol/L，28℃，黑暗條件下54rpm輕搖振蕩酶解10h； 5．楊樹(shù)原生質(zhì)體純化采用2次漂浮離心法，首先800rpm下離心4min，然后400rpm下離心8min，純化效果較好； 6．楊樹(shù)原生質(zhì)體融合較適合的電場(chǎng)參數(shù)為：AC強(qiáng)度100 V/cm，AC持續(xù)時(shí)間40s，DC強(qiáng)度1000V/cm，DC持續(xù)時(shí)間50μs，4次脈沖，2次循環(huán)； 7．融合親