刺葡萄（Vitis davidii Foex）原生質(zhì)體培養(yǎng)及體細(xì)胞融合技術(shù)體系的研究.pdf

1、本文以刺葡萄為試材，對其愈傷組織的誘導(dǎo)、離體培養(yǎng)、原生質(zhì)體分離、原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體再生植株進(jìn)行了研究；以刺葡萄和玫瑰香為試材，對葡萄原生質(zhì)體電融合技術(shù)體系進(jìn)行了比較系統(tǒng)的研究，旨在運用生物技術(shù)為刺葡萄的快速繁殖、抗性育種等方面的科學(xué)研究提供理論依據(jù)和操作技術(shù)。研究結(jié)果如下： 1.刺葡萄愈傷組織的誘導(dǎo)和離體培養(yǎng)研究本研究以刺葡萄的葉片、卷須、莖段、幼果、果柄為試材，以1/2MS和B5為基本培養(yǎng)基，通過不同濃度的生長TI調(diào)節(jié)劑配

2、比，探討了刺葡萄愈傷組織的誘導(dǎo)率及繼代培養(yǎng)情況；以刺葡萄愈傷組織為材料，在B5培養(yǎng)基上附加不同的生長TI調(diào)節(jié)劑種類及濃度配比，探討了刺葡萄芽的誘導(dǎo)、增殖和生根。結(jié)果表明：1/2MS和B5都是適合刺葡萄愈傷組織誘導(dǎo)的基本培養(yǎng)基；誘導(dǎo)材料以莖段對剖的誘導(dǎo)率最高，以B5+2,4-D3mg·L-1+6-BA0.01mg·L-1的效果最好，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100﹪，且愈傷組織的質(zhì)量高；繼代培養(yǎng)以B5+2,4-D0.5mg·L-1+6-BA0.2

3、mg·L-1為培養(yǎng)基，4周繼代一次，愈傷組織的密度適中，生長速度較快，褐變率低，僅為15﹪。刺葡萄愈傷組織的分化率很低，僅在B5+ZT0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1和B5+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.02mg·L-1兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)有少量胚狀體產(chǎn)生，胚狀體分化成苗的能力弱，分化率最高為13.3﹪，增殖培養(yǎng)以B5+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.05mg·L-1培養(yǎng)基為佳，4周可增殖6.4倍；生根培養(yǎng)以B5+

4、IBA1.0mg·L-1+NAA0.01mg·L-1培養(yǎng)基為好，4周平均生2.1條，根粗達(dá)2.4mm。 2.刺葡萄胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及胚性細(xì)胞懸浮系的建立本研究以刺葡萄的小花序、花蕾、花絲、花梗、子房和幼果為試材，以B5為基本培養(yǎng)基，在不同的生長TI調(diào)節(jié)劑配比和蔗糖條件下，研究其對誘導(dǎo)胚性愈傷組織的影響；同時探討其不同的繼代培養(yǎng)次數(shù)、培養(yǎng)密度和震蕩速度對刺葡萄胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)的影響，并觀察測定了懸浮細(xì)胞的生長情況。結(jié)果表明，

5、小花序是刺葡萄胚性愈傷組織誘導(dǎo)的良好材料，在B5+2,4-D2～3mg·L-1+6-BA1～3mg·L-1，蔗糖濃度為10﹪時，誘導(dǎo)率可達(dá)93.3﹪；懸浮培養(yǎng)以繼代培養(yǎng)1～4次的胚性愈傷組織為材料、培養(yǎng)密度以1.0～1.5：100、震蕩速度以80～100rpm·min-1為好；懸浮細(xì)胞的生長大致呈“S”型，每隔8～10d繼代一次能使愈傷組織細(xì)胞保持較高的胚性和活性。 3.刺葡萄原生質(zhì)體的分離研究本研究以刺葡萄的葉片、根尖和不同的

6、愈傷組織為試材，經(jīng)不同的酶液組合、不同酶解時間處理，采用篩網(wǎng)過濾、離心收集純化，最后測定原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。結(jié)果表明，原生質(zhì)體分離的材料以愈傷組織為佳，葉片次之，根尖較差；采用4次繼代培養(yǎng)以內(nèi)的愈傷組織為材料、以2﹪?yán)w維素酶+0.5﹪果膠酶+1﹪離析酶酶液組合，經(jīng)8h酶解，可收到較好的分離效果，原生質(zhì)體產(chǎn)量可達(dá)5.12×106個，活力可達(dá)88.57﹪。 4.刺葡萄原生質(zhì)培養(yǎng)及植株再生本研究以懸浮培養(yǎng)的刺葡萄胚性愈傷組織來源的原

7、生質(zhì)體為試材，研究了不同的培養(yǎng)基、碳源物質(zhì)、培養(yǎng)密度、培養(yǎng)方式和生長TI調(diào)節(jié)劑配比對原生質(zhì)體培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，以B5為基本培養(yǎng)基，以0.45mol.L-1葡萄糖和0.15mol·L-蔗糖為碳源，培養(yǎng)密度為5×105個.mL-1，附加2，4-D1mg.L-1和ZT0.025mg.L-1，用低熔點瓊脂糖固體包埋培養(yǎng)，5-6d出現(xiàn)第一次分裂，分裂頻率可達(dá)12.6﹪，植板率達(dá)3.8﹪，第50-55d可形成肉眼可見的小愈傷組織。并且通過獲得的

8、愈傷組織分步誘導(dǎo)培養(yǎng)可獲得刺葡萄原生質(zhì)體再生植株。 5.刺葡萄原生質(zhì)體電融合適宜條件的研究本研究以刺葡萄愈傷組織原生質(zhì)體和玫瑰香葡萄葉肉原生質(zhì)體為試材，研究了葡萄原生質(zhì)體電融合的適宜參數(shù)。結(jié)果表明，在交流電場頻率為1000～1500KHz，交流電場強度為100V·cm-1，直流脈沖電壓為1.25KV·cm-1，脈沖幅寬為60μs，5次脈沖，電融合液中甘露醇濃度為10﹪，CaCl2濃度為0.4mmol·L-1時，原生質(zhì)體的融合頻率

9、可達(dá)25﹪左右。 6.刺葡萄體細(xì)胞雜種的檢測通過對刺葡萄和玫瑰香葡萄融合體細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，獲得16株再生植株，并對再生植株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的檢測。結(jié)果表明，體細(xì)胞雜種苗具有葉片面積增大、葉片厚度增加、節(jié)間長度縮短等特點，融合體再生苗的染色體數(shù)為2n=4x=76。通過對親本和體細(xì)胞雜種的RAPD分析，6個隨機引物都能將親本明顯分開，對體細(xì)胞雜種后代而言，在S1398和S1469引物的擴(kuò)增產(chǎn)物中同時出現(xiàn)雙親的特異帶，在