洋蔥再生體系建立及原生質體分離條件的篩選.pdf

1、洋蔥，百合科蔥屬蔬菜作物，是世界第四大的蔬菜作物，在我國廣為栽培。洋蔥栽培已有5000多年的歷史，可謂歷史悠久。由于洋蔥是二、三年生異花授粉、異質性強、花器結構小、單株結籽少、自交2-3代后易發(fā)生退化、甚至失去育性等客觀因素的存在，導致常規(guī)育種上一直存在育種周期長，育種效率低等問題，因而目前在我國洋蔥生產(chǎn)上使用的品種大多數(shù)為國外品種，國內(nèi)育成品種卻是廖廖無幾。而原生質體不僅可以進行病毒侵染機理等基礎研究，還是遺傳轉化的理想受體，且原生質

2、體融合還可以克服不同物種細胞間的不親和障礙，為實現(xiàn)遠源物種間的體細胞雜交、培育新種開辟了新的途徑。
　　 本研究探討了不同的外植體獲得的洋蔥再生體系的建立，利用獲得的胚性愈傷組織作為材料進行原生質體分離，得到高產(chǎn)量的原生質體，探討了原生質體分離培養(yǎng)的影響因素，旨在建立洋蔥原生質體的再生培養(yǎng)體系，為以后導入一些優(yōu)良的目的基因及原生質體融合等遺傳操作，最終創(chuàng)造優(yōu)良的種質資源奠定基礎。
　　 本研究的主要結果如下：
　　

3、 1、建立了洋蔥無菌苗鱗莖盤再生體系：愈傷誘導最佳培養(yǎng)基為MS+2，4-D1.0mg/L+6-BA1.0mg/L，出愈率都在90％以上；芽分化最佳培養(yǎng)基為NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L，芽分化率為81.67%。
　　 2、建立了洋蔥花蕾再生培養(yǎng)體系：愈傷最佳誘導培養(yǎng)基為MS+2，4-D2mg/L+6-BA4mg/L，花蕾出愈率38.33%，平均愈傷率63.83%，直接芽誘導率為3%，均為各組合最高值；芽分化最佳培

4、養(yǎng)基為6-BA2.0mg/L+NAA1.0mg/L，誘導率可得77.88%。
　　 3、選用甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑，確定了洋蔥愈傷的滲透壓為0.6mol/L。
　　 4、建立了洋蔥愈傷原生質體快速分離體系：
　　 (1)以愈傷組織為游離材料的的最佳酶液組合為0.6M甘露醇+0.1% MES+2.0%Cellulase Onozuka R-10+0.1%PectolyaseY-23+0.5%Macerozyme R-

5、10，溶于CPW溶液中，pH為5.8，在25℃黑暗條件下，酶解5-6h為最佳。篩選條件時，離心600轉/min，培養(yǎng)12d的愈傷材料為最佳條件。
　　 (2)原生質體培養(yǎng)初步研究發(fā)現(xiàn)：洋蔥懸愈傷分離得到的原生質體，采用固液雙層培養(yǎng)法和液體淺層培養(yǎng)法，在培養(yǎng)密度為1×105個/mL時，在MS+1mg/L6-BA+1mg/L NAA+0.1%水解酪蛋白+0.2mol/L葡萄糖+0.2mol/L蔗糖+0.6mol/L甘露醇，培養(yǎng)基上觀