麻花艽(Gentiana straminea)原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)研究.pdf

1、麻花艽(Gentiana straminea Maxim)又名麻花秦艽,為龍膽科植物,主要分布于青藏高原地區(qū),是我國重點保護(hù)的野生藥材之一。近年來,由于臨床用藥量的增加和過度采挖,致使麻花艽野生資源日趨減少。因此,開展麻花艽的細(xì)胞工程研究則顯得尤為重要。為此,本研究以自然生長于青藏高原地區(qū)的麻花艽作為實驗材料,在建立起體細(xì)胞胚發(fā)生再生體系的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對其進(jìn)行原生質(zhì)體游離和培養(yǎng)研究,為麻花艽的人工繁育、優(yōu)良品種選育、遺傳轉(zhuǎn)化以及藥用資

2、源開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.以無菌苗葉片為外植體,研究建立了麻花艽體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生體系。以MS為基本培養(yǎng)基,附加2.0 mg·L-12,4-D和0.5 mg·L-16-BA,適于胚性愈傷組織的誘導(dǎo);胚性愈傷組織在含有0.5 mg·L-12,4-D的MS培養(yǎng)基上繼代后,在附加3.0 mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基上,最高再生頻率(93.8％)和每克愈傷組織再生最高芽數(shù)(31.7)被獲得;再生芽

3、在不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基上就能正常生根;再生植株移栽到盆土中,大約有90%的苗存活,展示了正常的生長。
　　2.通過HPLC測定了不同發(fā)育時期體細(xì)胞胚中的龍膽苦苷含量。隨著麻花艽體細(xì)胞胚的發(fā)育,龍膽苦苷含量逐漸增加,球形體胚的龍膽苦苷含量為13.8mg·g-1 DW,而子葉體胚則增加到22.2 mg·g-1 DW。由體細(xì)胞胚再生的苗中龍膽苦苷含量為30.7 mg·g-1 DW,高于親本苗的23.4mg·g-1 DW。

4、　　3.采用酶法分離原生質(zhì)體,比較了不同外植體、滲透壓、酶解時間、預(yù)處理和培養(yǎng)方法對原生質(zhì)體游離、分裂和再生的影響,研究建立了麻花艽胚性愈傷組織來源原生質(zhì)體的再生體系。0.5~0.6 mol·L-1甘露醇為游離葉片原生質(zhì)體的適宜滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度;5 h為游離葉片原生質(zhì)體的最適酶解時間。葉片經(jīng)0.6 mol·L-1甘露醇預(yù)處理60 min后,提高了原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力。從葉片中游離的原生質(zhì)體產(chǎn)量高于胚性愈傷組織;但其活力低于后者。在3種培

5、養(yǎng)方法中,固-液雙層培養(yǎng)和液體淺層培養(yǎng)優(yōu)于固體培養(yǎng)。在液體淺層培養(yǎng)中,葉片來源的原生質(zhì)體在第6 d開始第一次細(xì)胞分裂,培養(yǎng)14 d后的分裂頻率為17.6%,培養(yǎng)28 d后有2.4%的細(xì)胞形成細(xì)胞團(tuán),但沒有再生愈傷組織;而胚性愈傷組織來源的原生質(zhì)體在第3 d開始第一次細(xì)胞分裂,培養(yǎng)14 d后的分裂頻率為31.7%,培養(yǎng)28 d后的細(xì)胞團(tuán)形成頻率為7.9%,均優(yōu)于葉片來源的原生質(zhì)體,并最終形成了再生愈傷組織。
　　4.從細(xì)胞學(xué)、生化和