酶工程第五章酶、細胞、原生質體固定化

1、酶工程（Enzyme Engineering）,——讓工廠高效、安靜、美麗如畫的工程,工作原理: 利用試紙上的固定化酶 (葡萄糖氧化酶, Glucose oxidase , GOD) 與血液中的葡萄糖反應產生的電流來測血糖值。,強生穩(wěn)豪倍易血糖儀,葡萄糖氧化酶電極,酶電極示意圖 ß-D-葡萄糖＋O2 D-葡萄糖酸-1, 5-內酯＋H2O2,,半透膜,酶膠層,感應電極,第六章 酶、細胞、

2、原生質體固定化,1. 酶（Enzyme）,Organic chemical substance (a catalyst) formed in living cells, able to cause changes in other substance without being changed itself.活細胞產生的，能在細胞內外起催化作用的生理活性物質。,知識點回顧,酶,（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子,酶的催化專一性主要決定于

3、酶蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學基團的載體。,2. 酶的組成,必需基團：這些基團若經化學修飾使其改變，則酶的活性喪失。,活性中心：酶分子中直接與底物結合，并和酶催化作用直接相關的部位。,必需基團,3. 酶的活性中心（active center）,優(yōu)點：① 催化效率高 ② 專一性強 ③ 反應條件溫和 ④ 催化活性受到調節(jié)和控制

4、,4. 酶的特性,缺點：① 溶液酶很不穩(wěn)定 ② 增加分離的難度和費用 ③ 影響產品質量 ④ 回收困難，一次性使用,固定化技術——固定化酶（immobilized enzyme）,有效改善方法之一思路：設計一種方法，將酶束縛于特殊的相中，使它與整體分開但仍能進行底物和效應物的分子交換。效果：固定化的酶可像一般化學反應中的固體催化劑一樣，既有

5、酶催化特性，又有一般化學催化劑可回收、反復使用等優(yōu)點，并可使生產工藝連續(xù)化、自動化。,酶工程原理和基本過程 菌種→擴大培養(yǎng)→發(fā)酵→發(fā)酵酶液→酶的提取→ 酶成品

6、 原料→ 前處理→ 殺菌→ 酶反應器 ← ↓ 反應液→ 產品提取→ 產品,,,酶的固定化,,固定化酶發(fā)展歷史,1916年，Nelson和Griffin發(fā)現

7、酶的固定化現象（蔗糖酶吸附到骨炭上仍具催化活性）。 20世紀50年代，Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯樹脂為載體，分別制成固定化的胃蛋白酶、淀粉酶等。1969年，千佃一郎首次在工業(yè)規(guī)模上用固定化氨基?；笍幕旌习被嶂猩aL-氨基酸。 1971年，第一屆國際酶工程會議在美國召開，會議的主題是固定化酶（immobilized enzyme） 。 我國：1970年（中科院微生物所、上海生化所）。,固定化酶發(fā)展歷史

8、,1973年，日本首次在工業(yè)上應用固定化大腸桿菌菌體中的天冬氨酸酶生產L-天冬氨酸。20世紀70年代后期：固定化細胞技術1982年，日本首次用固定化原生質體生產谷氨酸近年來，隨著納米材料和磁性材料等新材料的出現，使固定化酶又成為研究熱點，目前酶的固定化方法已超過200種。,本章主要內容,第一節(jié) 酶固定化第二節(jié) 細胞固定化第三節(jié) 原生質體固定化,第一節(jié) 酶的固定化,水溶性酶,水不溶性載體,水不溶性酶（固定化酶）,早期： 水

9、不溶酶（water insoluble enzyme） 固相酶（solid phase enzyme）,一、固定化酶的制備,1. 固定化酶（Immobilized enzyme）定義限制或固定于特定空間位置的酶，具體來說，是指借助物理或化學方法將酶固定于水不溶性載體，使得酶與整個流體分隔開，但仍能發(fā)揮催化效能的酶制劑形式。制備固定化酶的過程叫做酶的固定化。,優(yōu)點,（1）提高酶穩(wěn)定性（2）可反復或連續(xù)使

10、用；易于和反應產物分開；酶的使用效率提高，成本降低（3）酶反應過程可嚴格控制（4）產物溶液無酶殘留，簡化提純工藝；增加產物收率，提高產物質量（5）較游離酶更適合多酶反應,缺點,（1）固定化時酶活有損失（2）增加了生產初始成本（3）只能用于可溶底物且較小分子（4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應,2.固定化酶的特點,3. 固定化酶制備原則,（1）維持酶的催化活性及專一性（2）應有最小的空間位阻（3）酶與載體必須結合牢固，穩(wěn)定

11、性好（4）載體不與底物、產物或反應液發(fā)生化學反應（5）成本要低，有利于生產自動化、連續(xù)化,4. 酶的固定化方法,載體結合法,交聯法,包埋法,物理吸附,共價結合,離子結合,酶的固定化,脂質體,凝膠型,微囊型,,熱處理法,原理 ： 通過氫鍵、疏水作用和π-電子親和力等物理作用，將酶固定于水不溶性載體上。制備方法: a. 靜態(tài)法 (static procedure) b. 電沉積法 (electrodepo

12、sition procedure) c. 混和振搖裝載法 (mixing or shaking bath loading process) d. 反應器裝載法 (reactor loading process),載體結合法,（1）物理吸附法,常用載體,a. 無機吸附劑：硅藻土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微孔玻璃、羥基磷灰石、活性炭等。無機吸附劑的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附劑。,b. 有機吸附劑：纖維素

13、、膠原、火棉膠等。有機吸附劑的吸附容量一般較高，如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶等，吸附容量為70mg蛋白/cm2膜。,優(yōu)點 ① 活性中心不易被破壞，高級結構保持完整； ② 操作簡單，固定化和純化過程可能同時實現； ③ 酶失活后載體仍可再生。 缺點 ① 最適吸附酶量無規(guī)律可循，吸附量與酶活力不一定呈平行關系； ② 酶與載體結合力不強，酶易于脫落，導致酶活下降并污染產物。,物理吸附

14、法固定化酶舉例,,原理：酶通過離子鍵結合于具有離子交換基的水不溶性載體上。載體： 陰離子交換劑：如二乙基氨基乙基(DEAE)-纖維素、混合胺類-纖維素、四乙氨基乙基(TEAE) -纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。 陽離子交換劑：如羧甲基(CM)-纖維素、纖維素檸檬酸鹽、IR-200、Dowex-50等。,(2) 離子結合法,,,,制備方法 在一定pH、溫度、離子強度等條件下 ① 將酶液與載體混和攪拌數小時 ②

15、將酶液緩慢流過處理好的離子交換柱,優(yōu)點： ① 操作簡單，處理條件溫和。 ② 酶的高級結構和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞。 ③ 吸附容量大。缺點： ① 載體和酶的結合力弱，易受緩沖液種類或pH的影響。 ② 離子強度高時，酶易脫落。,①通過酶蛋白化學修飾來增加酶分子上電荷，能有效克服解吸附問題。 例：用水溶性乙烯-順丁烯二酸酐共聚物共價修飾的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE-纖維

16、素和DEAE-Sephadex載體有效的固定。這種固定幾乎是不可逆的吸附。 ②酶的吸附與解吸還與介質中離子強度、pH、溫度、蛋白質濃度及酶和載體的特性相關。 例：pH的變化影響到載體和酶的電荷，從而影響載體對酶的吸附。在等電點兩側(±1-2pH單位)吸附將明顯減少。 載體的表面積、多孔性及其預處理都影響對酶的吸附。,原理： 酶以共價鍵結合于載體上，即將酶分子上非活性部位功能

17、團與載體表面反應基團進行共價結合。酶蛋白的側鏈基團和載體表面上的功能基團之間形成共價鍵。,(3) 共價結合法,酶分子和載體連接的功能基團,① 酶蛋白N-端的氨基或Lys殘基的?-氨基。② 酶蛋白C-端的羧基、Asp殘基的β-羧基和Glu殘基γ-羧基。③ Cys殘基的巰基。④ Ser、 Thr 、 Tyr殘基的羥基。⑤ Phe和Tyr殘基的苯環(huán)。⑥ His殘基的咪唑基。⑦ Trp殘基的吲哚基。⑧ Arg殘基的胍基。,被偶聯

18、的基團應是酶活性的非必需基團，否則將導致酶失去活性。,,纖維素瓊脂糖膠葡聚糖凝膠甲殼質氨基酸共聚物甲基丙烯醇共聚物,常用載體,芳香氨基羥基羥甲基氨基,載體上的功能基團,酶分子上的非必需側鏈基團,氨基胍基羧基巰基咪唑基羥基,,,制備方法 載體上的功能基團與酶分子上的側鏈基團間不具有直接反應的能力，因此在偶聯反應前，需先進行載體活化或接上雙功能試劑，在載體上引進某種活潑基團，然后此活潑基團再與酶分子上某一基團

19、反應形成共價結合。,雙功能試劑（bifunctional reagent）,分子兩端各有一個相同或者不同的活性基團，它們可與其他分子上的基團發(fā)生共價結合而產生交聯作用的試劑。同型雙功能試劑異型雙功能試劑,,,,載體活化方法,1. 重氮法2. 疊氮法3. 溴化氰法4. 烷基化法,,① 重氮法(diazatitation)：適用于帶芳香氨基載體。載體先用亞硝酸鹽處理成重氮鹽衍生物，然后再在溫和的條件下和酶分子上相應的基團如酚羥

20、基、咪唑基或氨基直接進行偶聯。,,,,,② 疊氮法（acylazide reaction）： 適用于帶羥基、羧甲基載體，如CM-纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯-順丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲基纖維素為例，可在酸等作用下轉變?yōu)榀B氮衍生物，再與酶的氨基、羥基、酚羥基或巰基反應。,,,,,,③ 溴化氰法（cyanogen bromide reaction）：適用于帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等。在堿性條件下載體羥基和溴化氰反應生

21、成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶的氨基進行共價偶聯反應。,,,,④ 烷基化法（alkylation reaction）： 適用于含羥基的載體。 堿性條件下和三氯均三嗪等反應，引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、羥基或巰基等偶聯。,,,,優(yōu)點： 酶與載體結合牢固，穩(wěn)定性好，不易脫落。 缺點： ① 載體需要活化，操作復雜； ② 反應條件苛刻，反應較為劇烈； ③ 共價結合

22、可能影響酶的空間構象，進而影響酶的催化活性或產生空間位阻效應。,共價偶聯反應一般比較激烈，為了減少酶在偶聯過程中失效，應采取怎樣的保護措施？,共價偶聯反應中的保護措施,① 選擇適宜的固定化方法與相應的載體。② 嚴格控制反應條件，提高反應的專一性。③ 應用可逆抑制劑或底物，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團，避免試劑影響酶的活性構型和相應基團。如：在進行腺苷三磷酸酶(ATPase)固定化時，可先用對羥基汞苯甲酸(PHMB) 保護巰基，

23、然后通過疊氮反應將酶偶聯于羧甲基纖維素上，完成固定化后，再用還原劑使-SH活化，可得到高活性的固定化酶。,,交聯法,借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯作用，制成網狀結構的固定化酶 特點：共價鍵、不使用載體。 雙功能試劑：戊二醛、己二胺等。,,第一篇報道：戊二醛交聯羧肽酶，得到一種分子間交聯的固定化酶,,,,,酶分子之間共價交聯和與水不溶性載體共價偶聯（a）酶分子之間用雙功能基團的化學交聯試劑相互交聯成水不溶性的固定化酶；（b）酶分

24、子被偶聯到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶,共同點：均利用共價鍵結合不同之處：交聯法不使用載體,,,酶,優(yōu)點: 結合牢固，可以長時間使用缺點 ① 因交聯反應激烈，酶分子多個基團被交聯，酶活損失大； ② 顆粒較小，使用不便,向酶溶液中加入輔助蛋白的交聯過程，酶活回收率和機械強度較交聯酶法高。 用雙功能試劑使惰性蛋白與酶共交聯：酶在交聯反應過程中因化學修飾而引起失活，或因得到的酶量有限時，以一些輔助蛋白，如牛血清白

25、蛋白、明膠、膠原、抗體等與酶一起進行交聯。解決方法2：降低交聯劑濃度和縮短反應時間,解決方法1：酶與輔助蛋白交聯,先使用明膠（蛋白質）包埋后，再用戊二醛交聯；先用尼龍（聚酰胺類）膜或活性炭、Fe2O3等吸附后，再交聯。,解決方法3：與吸附法或包埋法聯合使用,,熱處理法,將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內而制備得到固定化菌體（死細胞）適用：熱穩(wěn)定性好的酶雙重固定化：與交聯法或其他固定化方法聯用,,原理：將聚

26、合物單體與酶溶液混合，再借助于聚合促進劑(包括交聯劑)的作用進行聚合，酶被包埋在聚合物中以達到固定化。類型：主要有凝膠包埋、半透膜包埋、脂質體包埋。,包埋法,1. 凝膠包埋 (gel entrapment) ① 常用凝膠,,天然膠：瓊脂、海藻酸鈣膠、角叉菜膠、明膠,合成膠：聚丙烯酰胺凝膠、光交聯樹脂,② 制備方法,以天然膠為載體（強度差）：先將天然物溶于含水介質，然后再與酶液混和，最后使之膠化，制成膠包埋的固定化酶。

27、如：膠原可以添加丁醇；角叉菜膠可以添加KCl，然后冷卻；海藻酸可添加CaCl2，使之以膠的形式沉淀下來。 以合成膠為載體（易失活）：先將酶和丙烯酰胺單體分散于水介質中，然后加入N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的聚丙烯酰胺凝膠中。,海藻酸鈉包埋胰蛋白酶步驟,凝膠孔徑應小于酶分子直徑，因而不適用于大分子底物或大分子產物的酶類的固定化,將酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊內。它使酶存在于類似細胞內的環(huán)境中，可以防止酶的脫落

28、，防止微囊外環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。同時，小分子底物能通過膜與酶作用，小分子產物經擴散而輸出。,2. 半透膜包埋法 (microencapsulation),,,乳化分散：取含有酶和親水性單體的水溶液，在不溶于水的有機溶媒中充分乳化。,表面聚合：將含有疏水性單體的有機溶媒加入到上述乳化液中，發(fā)生聚合反應，生成的薄膜把酶包圍起來形成微型膠囊球。,1,清洗：反應完成后，用有機溶劑洗去未反應的剩余單體。,,,,,,,微囊,酶液滴,

29、,例：尼龍膜界面聚合包埋,酶+己二胺(水) +庚二酰氯 (氯仿) 混合  乳化，二種單體(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有機相交界處聚合 形成包埋酶的尼龍膜珠粒 Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶,,,,,,,,原理：在酶

30、的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達到包埋的目的。表面活性劑(surfactant)：具有固定的親水親油基團，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質。該法不含化學反應，簡便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性。,表面活性劑乳化液膜法：,缺點：反應條件要求高，制備成本也較高。,微囊直徑幾微米～幾百微米，比表面積大，物質交換迅速低分子底物可以自由通過并進入微囊內，與酶反應后的生成物被排除在微囊外酶本身是高分子

31、物質不能通過微囊而被留在微囊中外部的蛋白分解酶、抗體等高分子物質也無法進入微囊內,優(yōu)點:,將酶包埋于脂質體(Liposome)中 脂質體：具有脂雙層結構和一定包囊空間的微球體。 特點： 具有一定的機械性能，能定向將酶等被包裹物攜帶到體內特定部位，然后將被包裹物質釋放。因此，其在藥物應用方面受到重視。,3. 脂質體（Liposome）包埋法,包埋法是目前應用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點：不與酶

32、蛋白氨基酸殘基反應，很少改變酶的高級結構，酶活回收率高。缺點：只適合作用于小分子底物和產物的酶。,,,,,,,用,,,微膠囊,,各種固定化方法的優(yōu)缺點比較,二、固定化酶的性質 影響酶催化活性的因素： 1. 構象改變和立體屏蔽 2. 分配效應和擴散限制效應,（1）酶的活力,一般下降解決辦法：考慮相應的固定化過程可能對酶的影響，避免損害酶的活性中心，有時在固定化反應體系中會加入抑制劑、底物或產物以保護酶的活性中心。例：乳糖

33、酶的固定化就采用在其抑制劑葡萄糖-?-內酯存在下進行聚丙烯酰胺凝膠的包埋，如此可獲得高活力的固定化乳糖酶。,（2）酶的穩(wěn)定性,一般提高原因：①固定化增加了酶活性構象的牢固程度， 可防止酶分子伸展變形。②抑制酶的自身降解。③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。,對熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度,A固定化酶,B游離酶,如：氨基?；?，70℃，15分鐘，酶失去活性。而固定化后， 70℃，15分鐘，有>80%活性。,對蛋

34、白酶水解作用穩(wěn)定性增強,對變性劑作用的穩(wěn)定性提高,保藏穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性提高 天然胰凝乳蛋白酶在pH 4.1，4℃保存4個月，殘留活力僅為原活力的2%。偶聯于瓊脂糖后，在同樣條件下，卻可保存82%的活力，有利于運輸、貯存和重復使用。,（3）酶的最適溫度,最適溫度與酶穩(wěn)定性有關：多數酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。,例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高5～10℃；以共價結合法固定化

35、的色氨酸酶，其最適溫度比游離酶高5～15℃。,同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。 如：氨基?；赣肈EAE—葡聚糖凝膠經離子鍵結合法固定化后，其最適溫度(72℃)比游離酶的最適溫度(60℃)提高12℃；用DEAE—纖維素固定化，其最適溫度(67℃)比游離酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基?；?，其最適溫度卻比游離酶則有所降低。,（4）酶的最適pH值,酶固定化后，對底物 作用的最適pH和酶—

36、 pH曲線常發(fā)生偏移原因：微環(huán)境表面電荷 性質的影響,pH對固定化前后天冬酰胺酶活力的影響,,,帶負電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的高,① 載體的帶電性質對最適pH的影響,帶正電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的低,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,H+,H+,H+,H+,H+,H+,H+,偏酸微環(huán)境,OH-,OH-,OH-,OH-,OH-,OH-,H+,H+,大環(huán)境偏堿,酶,,不帶電荷的

37、載體，固定化酶最適pH值一般不變,② 產物酸堿性對最適pH值的影響,酸性: 固定化酶的最適pH值比游離酶的高 堿性: 固定化酶的最適pH值比游離酶的低 中性: 固定化酶的最適pH值一般不變 原因: 載體障礙產物的擴散,固定化酶的表觀米氏常數Km隨載體的帶電性能變化。 固定化載體與底物電荷相反，固定化酶的表觀Km值降低。 固定化載體與底物電荷相同，固定化酶的表觀Km值增加。,（5）酶的動力學特征,（6）酶的底物特異性,與底物分

38、子量的大小有關 作用于低分子量底物的酶，沒有明顯變化 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往會發(fā)生變化。 如：固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽的作用保持不變，而對酶蛋白的作用僅為游離酶的3%左右 原因：載體的空間位阻作用,氨基酸的分類,脂肪族氨基酸：包括一氨基一羧基酸、一氨基二羧基酸及其酰胺衍生物、二氨基一羧基酸芳香族氨基酸雜環(huán)族氨基酸雜環(huán)亞氨基酸,一氨基一羧基酸,,,,,,一氨基二羧基酸及其酰胺