改造大腸桿菌提高丁二酸生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率.pdf

1、分類號：Q81密級：公開學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號：11809945改造大腸桿菌提高丁二酸生產(chǎn)速率和轉(zhuǎn)化率EngineeringEscherichiacoliforimprovingsuecinateproductivityandyield工程領(lǐng)域名稱：輕工技術(shù)與工程(發(fā)酵)研究方向：合成生物學(xué)指導(dǎo)教師姓名：肖冬光教授張學(xué)禮研究員研究生姓名：陳晶申請學(xué)位級別：工程碩士論文提交日期：2014年5月論文課題來源：國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃

2、學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要丁二酸又叫琥珀酸，分子式為：COOHCH2CH2COOH，分子量為11809，作為四碳二羧酸的一種，是美國能源部認(rèn)定的12種最具價值的大宗化學(xué)品之一，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)等方面。目前，丁二酸的生產(chǎn)都是基于石油資源的化學(xué)合成路線。但此種方法能耗高，污染大。微生物發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸引起了科學(xué)家們的極大關(guān)注，尤其對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸做了很多研究。本研究通過對大腸桿菌丙酮酸脫氫酶(PDH)和四碳二羧

3、酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的改造，提高大腸桿菌生產(chǎn)丁二酸的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)速率。還原力NADH是化合物生物合成中不可或缺的輔因子，提高還原力的供給有利于提高丁二酸的轉(zhuǎn)化率。PDH是催化丙酮酸脫羧的關(guān)鍵酶，該過程中伴隨著NADH的釋放。但PDH厭氧酶活極低，且受NADH抑制嚴(yán)重。本研究通過對不同二氫硫辛酸脫氫酶(LpdA)突變組合的分析，獲得了厭氧條件下PDH酶活較高，且NADH抑制減弱的突變體，其PDH酶活為野生型19倍。隨后，以產(chǎn)乙醇大腸桿菌為基礎(chǔ)改造平

4、臺從轉(zhuǎn)錄水平對PDH進(jìn)行改造，將PDH酶活提高至99pmol／mg／min，并將其應(yīng)用于提高丁二酸的生產(chǎn)能力。結(jié)果表明，通過對PDH的改造，使PDH的酶活提高了579倍，丁二酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了23％和25％。四碳二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要調(diào)節(jié)四碳二羧酸(蘋果酸、富馬酸、丁二酸)的攝取、反向運(yùn)輸以及向外輸出。本研究通過敲除實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了四個四碳二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(DcuA，DcuB，DcuC，DcuD)對丁二酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果表明，單獨(dú)敲除沈

5、以和dcuD基因?qū)Χ《岙a(chǎn)量幾乎沒有影響：而單獨(dú)敲除出如和dcuC基因使丁二酸產(chǎn)量分別下降15％和11％；同時敲除如徊和如”C基因使丁二酸產(chǎn)量下降90％，由此推斷DcuB和DcuC是主要的丁二酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。本研究采用RBS文庫對沈徊和如“C基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控來提高丁二酸生產(chǎn)速率。結(jié)果表明，單獨(dú)調(diào)控DcuB丁二酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了8％和11％，單獨(dú)調(diào)控DcuC丁二酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別提高了18％和19％，協(xié)同改造DcuB和DcuC丁二酸的產(chǎn)