代謝工程方法改造大腸桿菌生產(chǎn)胸苷.pdf

1、胸苷是抗艾滋病藥物司他夫定（3'-脫氧-2',3'-雙脫氫胸苷）和疊氮胸苷的重要前體物質(zhì)。本文應(yīng)用代謝工程方法對Escherichia coli BL21（DE3）生物合成胸苷進行了較系統(tǒng)的研究，構(gòu)建了一系列生產(chǎn)胸苷的菌株。研究考查了嘧啶核苷酸的回補途徑與從頭合成途徑；考查了前體物NADPH和核糖-5-磷酸對胸苷積累的影響；還嘗試了增加甘氨酸或天冬氨酸前體物來進一步提高胸苷的產(chǎn)量。最終通過分批補料發(fā)酵評價胸苷工業(yè)化的可能性。得到的主要結(jié)

2、果如下：
　　首先，考查了嘧啶核苷酸回補途徑的胸苷積累的影響。采用組合敲除策略，敲除E. coli BL21嘧啶回補途徑編碼胸苷磷酸化酶、胸苷激酶和尿苷磷酸化酶的三個基因，分別是deoA、tdk、udp，構(gòu)建了BS01(ΔdeoA)、BS02(ΔdeoAΔtdk)和BS03(ΔdeoAΔtdkΔudp)菌株，其中BS03工程菌株的胸苷分解途徑完全被阻斷，能夠生產(chǎn)21.6 mg/L胸苷。
　　其次，為了增加合成胸苷前體物核糖-

3、5-磷酸和NADPH的供給，在BS03的基礎(chǔ)上進一步敲除EMP途徑的pgi基因，使工程菌BS04胸苷的產(chǎn)量提高到78.7 mg/L，其產(chǎn)量是BS03的3.6倍。結(jié)果表明pgi基因的敲除阻止葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)為果糖-6-磷酸，使葡萄糖-6-磷酸流向磷酸戊糖途徑，增加磷酸戊糖途徑的通量，為胸苷的合成提供更多的前體物。
　　隨后，為了解除嘧啶核苷酸從頭合成途徑中編碼第一個關(guān)鍵酶（天冬氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶）的pyrBI操縱子的反饋阻遏，在

4、BS04的基礎(chǔ)上敲除了pyrB上游的調(diào)控序列pyrL，BS05可以積累90.5 mg/L的胸苷。
　　最后，進一步考查了胸苷合成途徑的UDP到胸苷的核苷二磷酸還原酶(nrdA和nrdB)、核苷二磷酸激酶(ndk)、dUTP酶(dut)、胸苷酸合酶(thyA)和脫氧核糖核苷酸酶(ushA)。在p5C基礎(chǔ)上插入大腸桿菌自身的ushA、thyA、dut和ndk，構(gòu)建了pLS4質(zhì)粒。在pTRC99A基礎(chǔ)上插入nrdA和nrdB，構(gòu)建pLM

5、2質(zhì)粒。在BS05基礎(chǔ)上構(gòu)建了BS06（pLS4）、BS07（pLM2）和BS08（pLS4pLM2）。BS06可以積累100.7 mg/L的胸苷，BS07胸苷的產(chǎn)量達到169.2 mg/L。而最終菌株BS08在搖瓶發(fā)酵條件下胸苷的產(chǎn)量可以達到272 mg/L。通過分批補料發(fā)酵，BS08最終可以積累1248.8 mg/L的胸苷，生產(chǎn)率達到15.61 mg/(L·h),得率為12.5 mg/(g·glucose)。本研究結(jié)果表明經(jīng)過代謝工