大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)C4-二羧酸類物質(zhì)的代謝工程研究.pdf

1、大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)大腸桿菌利用甘油生產(chǎn)C4二羧酸二羧酸類物質(zhì)類物質(zhì)的代謝工程研究代謝工程研究MetabolicengineeringofEscherichiacolifC4dicarboxylicacidsproductionfromglycerol（國家自然科學基金項目資助NSFC21390201）（國家973計劃項目資助2011CBA00804）一級學科：化學工程與技術學科專業(yè)：生物化工作者姓名：李寧指導教師：趙學明天津大學化工學

2、院二零一四年十二月中文中文摘要摘要甘油作為生物柴油產(chǎn)業(yè)的主要副產(chǎn)物，日益成為一種廉價、可持續(xù)的生物發(fā)酵工業(yè)的原料和底物。C4二羧酸類物質(zhì)（琥珀酸、富馬酸和蘋果酸）在食品、制藥、化工等領域都有非常廣泛的應用。本文通過代謝工程和進化工程的策略構(gòu)建了能夠利用甘油為底物高效生產(chǎn)C4二羧酸類物質(zhì)的大腸桿菌菌株。首先利用基元模式分析的方法對大腸桿菌在好氧、微氧和厭氧條件下利用甘油為底物生產(chǎn)琥珀酸的代謝網(wǎng)絡模型分別進行了系統(tǒng)的計算和分析。根據(jù)基元模式

3、分析的結(jié)果，構(gòu)建了好氧琥珀酸生產(chǎn)菌株，琥珀酸的得率達到0.22molmol甘油，但副產(chǎn)物α酮戊二酸會大量積累。通過對敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的菌株進行適應性進化，提高了乙醛酸循環(huán)的通量，進而使得α酮戊二酸的產(chǎn)量降低了46%，琥珀酸的得率提高了30%。通過過表達α酮戊二酸脫氫酶，進一步大大降低了α酮戊二酸的產(chǎn)量，并將琥珀酸的得率提高了20%，達到了好氧發(fā)酵最大理論得率的67%。此外，異檸檬酸脫氫酶的編碼基因icdA的編碼區(qū)在進化過程中發(fā)

4、生了錯義突變G583T。通過將該突變引入對照菌株，大大提高了琥珀酸的得率，說明該突變是造成乙醛酸循環(huán)通量提高的主要原因。通過進化工程和代謝工程策略構(gòu)建的菌株E2ΔsdhppcsucAB在1L的發(fā)酵罐中通過補料分批發(fā)酵，能夠消耗120gL甘油產(chǎn)生43.2gL琥珀酸。以構(gòu)建的好氧條件下的琥珀酸高產(chǎn)菌株為基礎，通過敲除三個富馬酸酶，成功地使大腸桿菌能夠利用甘油為底物生產(chǎn)富馬酸，但會大量積累副產(chǎn)物乙酸。為了降低副產(chǎn)物乙酸的積累，嘗試了多種代謝工

5、程方法。其中通過過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶或乙醛酸循環(huán)操縱子來提高回補途徑的通量，能有效的降低乙酸和提高富馬酸的產(chǎn)量。在1L的發(fā)酵罐中通過補料分批發(fā)酵方式，菌株EF02(pSCppc)共消耗了94gL甘油，產(chǎn)生了41.5gL富馬酸，富馬酸的得率達到最大理論得率的70%。基于基元模式分析，構(gòu)建了大腸桿菌在微氧條件下利用甘油生產(chǎn)琥珀酸的菌株，并在此基礎上通過進一步的代謝工程策略構(gòu)建了利用甘油生產(chǎn)蘋果酸的菌株，并研究了多個途徑對蘋果酸生產(chǎn)的