利用重組大腸桿菌生產(chǎn)L-色氨酸的研究.pdf

1、L-色氨酸作為一種非常重要的芳香性氨基酸，是人體必需的八種氨基酸之一。在生物體內(nèi)，L-色氨酸可以合成5-羥基色胺、煙酸、色素、生物堿、輔酶、吲哚乙酸等重要的生物活性物質(zhì)，對人和動物的生長發(fā)育起重要作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等方面。目前，世界市場色氨酸年需求量在萬噸以上，并且以每年10％的速度增長。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，L-色氨酸廣泛應(yīng)用于氨基酸注射液、必需氨基酸藥品及水解蛋白質(zhì)的添加劑等。L-色氨酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物5-羥色胺，具有抗抑郁癥、提高睡

2、眠質(zhì)量、抗高血壓及鎮(zhèn)痛作用。作為食品添加劑，L-色氨酸可以強(qiáng)化機(jī)體對植物蛋白的利用效率。在飼料中添加L-色氨酸，可以調(diào)節(jié)飼料中氨基酸的平衡，促進(jìn)家禽家畜的生長。
　　 L-色氨酸的生產(chǎn)最早主要依靠化學(xué)合成法和蛋白質(zhì)水解法，但是這些方法存在著材料來源有限、周期長、工藝復(fù)雜等缺點，因而逐漸被淘汰。由于具有的成本低廉、原料來源廣泛、環(huán)境污染小等特點，微生物生產(chǎn)L-色氨酸已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。微生物法大體上可以分為直接發(fā)酵法、微生物轉(zhuǎn)化

3、法和酶法。
　　 微生物轉(zhuǎn)化法采用糖類作為碳源，同時添加L-色氨酸的前體物如鄰氨基苯甲酸、吲哚等，利用微生物的L-色氨酸合成酶系來合成L-色氨酸。但是當(dāng)轉(zhuǎn)化液中前體物濃度較高時，轉(zhuǎn)化率會出現(xiàn)下降。另外由于前體物的價格昂貴，不利于降低成本。酶法是利用微生物中L-色氨酸生物合成酶系催化功能生產(chǎn)L-色氨酸。它能夠利用化工合成的前體為原料，同時又具有產(chǎn)物濃度高、純度高、副產(chǎn)物少、操作簡便等優(yōu)點，是一種成本較低的生產(chǎn)L-色氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)

4、方法。但是該方法需要篩選高活力的酶和較高的底物濃度推動反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)平衡不容易掌握。直接發(fā)酵法是以葡萄糖等廉價原料為碳源，利用篩選的如谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌等優(yōu)良的L-色氨酸生產(chǎn)菌種，生產(chǎn)L-色氨酸。對這種方法的研究起步比較早，但是在相當(dāng)長的一段時間內(nèi)達(dá)不到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。主要原因是從葡萄糖到L-色氨酸的生物合成途徑較長，在正常情況下代謝流也比較弱。而且L-色氨酸的合成需要多種前體物，生物合成途徑中的調(diào)控機(jī)制比較復(fù)雜，種種因素限制了

5、L-色氨酸產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。
　　 近年來，隨著代謝工程、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和合成生物學(xué)的發(fā)展，人們通過分析代謝途徑，過量表達(dá)內(nèi)源基因或引入外源基因，消除競爭支路，成功構(gòu)建了合成特定目標(biāo)化合物并用于工業(yè)化生產(chǎn)的工程菌株。目前代謝工程在微生物合成氨基酸、有機(jī)酸、萜類化合物、聚羥基脂肪酸酯、生物燃料等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。大腸桿菌因其易于培養(yǎng)、遺傳背景清楚、遺傳操作簡便等優(yōu)點被大規(guī)模應(yīng)用于代謝工程改造用于合成各種有價值的化合物。
　　

6、 針對L-色氨酸合成途徑中的眾多限制性因素，本論文首先利用基因的敲除、定點突變及過量表達(dá)技術(shù)，對野生型大腸桿菌W3110進(jìn)行了代謝工程改造。通過敲除阻遏蛋白TrpR，解除了其對L-色氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶的阻遏;通過敲除色氨酸酶TnaA，降低了已經(jīng)合成的L-色氨酸在胞內(nèi)的降解;通過敲除編碼葡萄糖依賴的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中酶(II)BC組分的ptsG基因，使大腸桿菌依賴于磷酸烯醇式丙酮酸的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)部分失活，降低了細(xì)胞內(nèi)磷酸烯醇式丙酮酸(

7、PEP)的消耗，從而能更多的流入L-色氨酸合成途徑。為了進(jìn)一步提高L-色氨酸的產(chǎn)量，在低拷貝質(zhì)粒pCL1920上過量表達(dá)了定點突變解除反饋抑制的鄰氨基苯甲酸合成酶trpE3、3-脫氧-D-阿拉伯庚酮酸-7磷酸(DAHP)合酶aroG1以及磷酸戊糖途徑中編碼轉(zhuǎn)酮酶的基因tktA，構(gòu)建了質(zhì)粒pTAT，并且轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌中構(gòu)建了L-色氨酸基本產(chǎn)生菌株GPT1001。搖瓶發(fā)酵顯示該菌株的L-色氨酸可以達(dá)到1.2 gl-1，為下一步的改造奠定了

8、基礎(chǔ)。
　　 色氨酸衰減子是重要的L-色氨酸合成調(diào)控元件，能夠精細(xì)控制細(xì)胞內(nèi)L-色氨酸的合成。另外，色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄水平對L-色氨酸的產(chǎn)量也有著十分重要的影響。為了消除大腸桿菌色氨酸衰減作用并且提高色氨酸操縱子的表達(dá)水平，我們利用五個拷貝串聯(lián)重復(fù)的tac核心啟動子組成的5CPtacs啟動子，一步法完成了色氨酸衰減子的敲除及色氨酸操縱子野生型啟動子的替換，成功構(gòu)建了重組大腸桿菌GPT1002。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)五個色氨酸操

9、縱子基因的轉(zhuǎn)錄均出現(xiàn)上調(diào)，上調(diào)幅度為1.67-9.21倍不等。其中trpE基因的轉(zhuǎn)錄水平提高約9.21倍，而其他四個基因轉(zhuǎn)錄水平的只提高了約2倍。另外，aroG基因的轉(zhuǎn)錄水平也上調(diào)了9.29倍。搖瓶發(fā)酵實驗表明，GPT1002的生長未受到影響，經(jīng)過36h培養(yǎng)，可以積累1.7 g l-1的L-色氨酸，比對照菌株GPT1001高出31％。最后，對GPT1002進(jìn)行了5-1發(fā)酵罐發(fā)酵， L-色氨酸產(chǎn)量可以達(dá)到10.15 g l-1，證明了我們

10、代謝途徑改造是有效的。
　　 在大腸桿菌中W3110中，存在著Mtr、TnaB和AroP三個透過酶參與L-色氨酸的吸收。為了研究透過酶的敲除對L-色氨酸產(chǎn)量的影響，我們在L-色氨酸生產(chǎn)菌株GPT1002的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了三個L-色氨酸透過酶的單敲除菌株，并進(jìn)行了L-色氨酸的吸收能力進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明TnaB的缺失能夠有效降低細(xì)胞的L-色氨酸吸收能力。搖瓶發(fā)酵檢測中，TnaB缺失菌株L-色氨酸的產(chǎn)量最高，能夠達(dá)到2.05 g l-

11、1。在單敲除菌株的基礎(chǔ)上我們又構(gòu)建了L-色氨酸透過酶雙敲除菌株GPT1014、GPT1015和GPT1016，搖瓶發(fā)酵顯示，所有的雙敲除菌株生長都受到了嚴(yán)重影響，最大OD600約為初始菌株GPT1002的一半左右。其中AroP和TnaB雙敲除菌株GPT1014呈現(xiàn)出了最高的L-色氨酸產(chǎn)量，2.44 g l-1。另外兩個雙敲除菌株L-色氨酸產(chǎn)量極低，只有50-60 mg l-1。最后，我們構(gòu)建了L-色氨酸透過酶三敲除菌株GPT1017。G

12、PT1017在搖瓶發(fā)酵中的生長得到了恢復(fù)，L-色氨酸產(chǎn)量也超過了所有的突變菌株和初始菌株，達(dá)到2.79 g l-1，比GPT1002高出51.6％。在5-1發(fā)酵罐中，L-色氨酸產(chǎn)量可以進(jìn)一步提高，達(dá)到16.3 g l-1。另外，我們還對構(gòu)建的敲除突變菌株的三個中心代謝途徑的關(guān)鍵基因，檸檬酸合成酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測。在突變菌株中，三個基因的轉(zhuǎn)錄水平均明顯下降，特別是在GPT1015和GPT

13、1016中，三個基因的轉(zhuǎn)錄水平下降到對照菌株的0.01-0.08倍左右，這說明透過酶的敲除能夠直接或者間接的影響代謝流量的分布。而在GPT1017中，這三個基因的轉(zhuǎn)錄水平有不同程度的恢復(fù)，這也與該菌體的生長和L-色氨酸產(chǎn)量恢復(fù)的結(jié)果也是一致的。
　　 聚β-羥基丁酸(PHB)是研究的最為透徹的一類PHA，在細(xì)菌體內(nèi)主要被用作碳源和能源的儲備物。為了減少重組菌株GPT1002的乙酸分泌，提高細(xì)胞對碳源的利用效率，我們將來自真氧產(chǎn)堿

14、桿菌的phaCAB操縱子轉(zhuǎn)入GPT1002，構(gòu)建了L-色氨酸和PHB聯(lián)產(chǎn)菌株GPT2000。在搖瓶發(fā)酵的條件下，成功檢測到了PHB的積累，并且L-色氨酸的產(chǎn)量比對照提高了11.6％。RT-PCR結(jié)果表明，PHB的積累能夠顯著提高色氨酸操縱子基因的轉(zhuǎn)錄，最高可達(dá)4倍左右，這可能是L-色氨酸產(chǎn)量提高的原因?？紤]到木糖的添加可能有利于L-色氨酸前體物E4P的合成，同時可以節(jié)約葡萄糖運輸過程中消耗的PEP，我們檢測了以不同比例的葡萄糖和木糖作為

15、碳源對兩種產(chǎn)物及副產(chǎn)物乙酸的影響。結(jié)果表明，PHB的積累和乙酸的分泌隨著木糖比例的的增加而增加，當(dāng)以木糖為唯一碳源時兩者均達(dá)到最大值。而對于L-色氨酸，在16 g l-1葡萄糖和4g l-1木糖條件下，產(chǎn)量達(dá)到最高2.24 g l-1。在最優(yōu)的葡萄糖和木糖比例條件下，我們對重組菌株GPT2000進(jìn)行了5-1發(fā)酵罐發(fā)酵，L-色氨酸和PHB的產(chǎn)量分別可以達(dá)到14.4 g l-1和9.7％(w/w)。
　　 最后我們建立了一種能夠在基

16、因組上整合隨機(jī)拷貝數(shù)基因片段的方法。利用條件復(fù)制子oriR6Kγ，構(gòu)建了整合質(zhì)粒pTKG，并利用卡那霉素抗性基因和綠色熒光蛋白作為報告基因進(jìn)行篩選。實驗結(jié)果表明，我們成功在基因組上隨機(jī)整合了1-12個拷貝的基因片段?？紤]到恢復(fù)培養(yǎng)時間的長短可能會影響整合的最大拷貝數(shù)，我們檢測了不同恢復(fù)培養(yǎng)時間的影響。1h的恢復(fù)培養(yǎng)時間對我們的隨機(jī)拷貝數(shù)的整合是最佳的，增加或減少恢復(fù)培養(yǎng)時間反而會降低整合的最大拷貝數(shù)。接下來，通過在重組大腸桿菌GPT10

17、2T基因組上整合不同拷貝數(shù)的aroK基因并分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pTAT進(jìn)行發(fā)酵檢測，我們發(fā)現(xiàn)在基因組上存在3個拷貝的aroK基因時，單位菌體的L-色氨酸產(chǎn)量最高。
　　 本論文首先構(gòu)建了L-色氨酸基本產(chǎn)生菌株GPT1001，并在此基礎(chǔ)上通過啟動子替換等手段，提高了L-色氨酸的產(chǎn)量。本論文系統(tǒng)研究了大腸桿菌L-色氨酸透過酶的敲除對L-色氨酸產(chǎn)量的影響，并首次構(gòu)建了L-色氨酸和PHB的聯(lián)產(chǎn)菌株，檢測了PHB積累對L-色氨酸合成及色氨酸操縱子