代謝工程改造谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的研究.pdf

1、本研究通過對(duì)中心碳代謝途徑、血紅素合成途徑、細(xì)胞壁的合成途徑以及甘氨酸途徑的改造，研究了谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）的潛力。
　　首先，通過克隆來自類球紅細(xì)菌的5-氨基乙酰丙酸合酶基因（hemA）在谷氨酸棒桿菌中實(shí)現(xiàn)了5-ALA的積累；其次，通過失活乙酸乳酸生成途徑，進(jìn)一步提高了5-ALA的產(chǎn)量；隨后，通過改造回補(bǔ)途徑，5-ALA的產(chǎn)量達(dá)到了2.06g/L；進(jìn)一步失活琥珀酰CoA競(jìng)爭(zhēng)途徑不能有效提高5-ALA的產(chǎn)

2、量。
　　5-ALA的合成是血紅素合成途徑的限速步驟，為了研究血紅素合成途徑相關(guān)基因?qū)?-ALA積累的影響，首先單獨(dú)過表達(dá)了hemC、hemD、hemE和hemN基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用低拷貝質(zhì)粒pEP2過表達(dá)hemD基因可以使5-ALA的產(chǎn)量提高29.2％；下調(diào)hemH基因和hemY基因的表達(dá)水平可以分別使5-ALA的產(chǎn)量提高14.0%和5.3%。
　　細(xì)胞壁對(duì)5-ALA的分泌影響很大，而青霉素結(jié)合蛋白在細(xì)胞壁的合成過程中起著重

3、要的作用。本文分別敲除了四個(gè)編碼高分子量青霉素結(jié)合蛋白的基因（包括pbp1a，pbp1b，pbp2a和pbp2b）。結(jié)果表明，單獨(dú)敲除pbp1a，pbp1b以及pbp2b可以使5-ALA的產(chǎn)量分別提高13.5%，29.5%和22.2%。
　　為了進(jìn)一步加速5-ALA的分泌，本文利用低拷貝質(zhì)粒pEP2分別過表達(dá)了不同來源的蘇氨酸運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基因。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)來自大腸桿菌的rhtA基因可以加速5-ALA的運(yùn)輸，獲得的工程菌C.gl

4、utamicum R1生產(chǎn)5-ALA的能力提高了18.5%。本文考察了不同發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件對(duì)C.glutamicum R1生產(chǎn)5-ALA的影響，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件，C.glutamicum R1能夠生產(chǎn)3.40g/L5-ALA。在添加青霉素的條件下，C.glutamicum R1在5L發(fā)酵罐中能夠生產(chǎn)10.43g/L5-ALA。
　　為了增強(qiáng)甘氨酸合成途徑的通量，本文對(duì)該途徑進(jìn)行了代謝工程改造。在不添加甘氨酸的情

5、況下，過表達(dá)谷氨酸棒桿菌本身的絲氨酸操縱子serAΔ197CB可以使5-ALA的產(chǎn)量提高69.2%；進(jìn)一步敲除L-絲氨酸脫氨酶編碼基因sdaA使5-ALA的產(chǎn)量明顯降低；在過表達(dá)絲氨酸操縱子的基礎(chǔ)上過表達(dá)glyA基因獲得工程菌C.glutamicum AG3，該菌株生產(chǎn)5-ALA的能力提高了1.48倍。對(duì)甘氨酸合成途徑的改造也可以提高工程菌在添加甘氨酸情況下生產(chǎn)5-ALA的能力，在同樣添加7.5g/L甘氨酸的情況下，C.glutamic