高效利用戊糖產(chǎn)琥珀酸谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建.pdf

1、木質(zhì)纖維素是自然界中含量最豐富的天然可再生物質(zhì)，是微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物基產(chǎn)品，保持可持續(xù)發(fā)展的重要原料來(lái)源。谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是非致病性革蘭氏陽(yáng)性菌，是重要的氨基酸、有機(jī)酸等產(chǎn)品的工業(yè)生產(chǎn)菌株。本文圍繞C. glutamicum高效利用戊糖發(fā)酵琥珀酸，以琥珀酸生產(chǎn)菌SAZ3為出發(fā)菌株進(jìn)行代謝工程改造，通過(guò)篩選木糖利用基因，過(guò)表達(dá)非氧化磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶基因，以及強(qiáng)化木糖與阿拉伯糖的運(yùn)輸效

2、率，使工程菌株在厭氧條件下高效發(fā)酵木糖和阿拉伯糖生產(chǎn)琥珀酸。
　　通過(guò)比較來(lái)自大腸桿菌、多粘類(lèi)芽孢桿菌、野油菜黃單胞菌和天藍(lán)色鏈霉菌的木糖利用基因在谷氨酸棒桿菌中差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)來(lái)自野油菜黃單胞菌的xylAB在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)效率最高，重組菌I-xcb的最大比生長(zhǎng)速率為0.23 h-1。
　　構(gòu)建的利用木糖厭氧發(fā)酵琥珀酸工程菌株CGL11，初始生物量為7.5g(CDW)?L-1時(shí)，其能在20 h完全利用30 g?L-1木糖

3、，發(fā)酵產(chǎn)生28 g?L-1的琥珀酸，琥珀酸生產(chǎn)率為1.54 g?L-1?h-1，得率為0.93g琥珀酸（g D-木糖）-1，達(dá)到最大理論得率的83％，平均木糖消耗速率為1.69 g?L-1?h-1。
　　在菌株CGL11中過(guò)表達(dá)非氧化磷酸戊糖途徑基因tal和tkt，獲得菌株CGL21，考察非氧化磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶基因的擾動(dòng)對(duì)CGL21發(fā)酵木糖生產(chǎn)琥珀酸性能的影響。CGL21的琥珀酸生產(chǎn)率為1.72 g?L-1?h-1，比出發(fā)菌株C

4、GL11提高12%；琥珀酸得率為0.98g琥珀酸（g D-木糖）-1，比出發(fā)菌株CGL11提高5.37%；平均木糖消耗速率為2.06 g?L-1?h-1，比菌株CGL11提高22%。為進(jìn)一步提高工程菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)琥珀酸的能力，加快木糖的消耗速率及琥珀酸產(chǎn)率，在CGL21基因組上過(guò)表達(dá)來(lái)自B. subtilis的阿拉伯糖運(yùn)輸?shù)鞍拙幋a基因araE，獲得工程菌株CGL31。其保持了菌株CGL21的高琥珀酸得率和木糖利用速率，同時(shí)琥珀酸生產(chǎn)率為

5、2.06 g?L-1?h-1，比菌株CGL21提高20%。進(jìn)一步利用木糖在高糖高密度條件下厭氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸，菌株CGL31得率為0.92g琥珀酸（g D-木糖）-1，發(fā)酵產(chǎn)生99 g?L-1的琥珀酸，為目前報(bào)道的谷氨酸棒桿菌在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵木糖生產(chǎn)琥珀酸的最高產(chǎn)量，同時(shí)具有較高的琥珀酸得率。
　　在菌株CGL30中，表達(dá)來(lái)自野油菜黃單胞菌的木糖利用途徑基因xylAB和來(lái)自大腸桿菌的阿拉伯糖利用途徑基因araBAD，構(gòu)建同