基于基元模式分析產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構(gòu)建.pdf

1、運用計算系統(tǒng)生物學(xué)分析方法指導(dǎo)代謝工程改造已經(jīng)成為當(dāng)前研究的一個熱點?；Ｊ椒治鍪谴x途徑分析的一種，基元網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，分析時不需要動力學(xué)參數(shù)信息，得到網(wǎng)絡(luò)中所包含的所有路徑信息，被用于分析網(wǎng)絡(luò)的魯棒性、指導(dǎo)菌種改造等方面。CASOP算法基于基元模式分析，將產(chǎn)率和得率綜合考慮，用于模擬以產(chǎn)率目標(biāo)為主的代謝工程靶點。本文運用CASOP算法指導(dǎo)大腸桿菌好氧發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸代謝工程改造并進(jìn)行發(fā)酵試驗。
　　根據(jù)已報道的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，構(gòu)

2、建了以葡萄糖為碳源的大腸桿菌中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)。為了比較系統(tǒng)地研究羧化反應(yīng)對琥珀酸生產(chǎn)的影響，網(wǎng)絡(luò)中引入了由丙酮酸羧化酶PYC催化丙酮酸生成草酰乙酸的反應(yīng)，并將由蘋果酸酶MAEA催化蘋果酸生成丙酮酸的反應(yīng)分為兩個不可逆反應(yīng)。運用CASOP對所構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模擬，得到5個敲除靶點(sdhA,ackA-pta,poxB,mgsA,iclR)和5個過表達(dá)靶點(aceA,aceB,pyc,ppc,maeA)。
　　根據(jù)這些靶點對野生型大腸桿菌W

3、1485進(jìn)行基因操作，得到一系列工程菌株。對這些菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果顯示野生型大腸桿菌中琥珀酸沒有積累。突變株ZJG13(sdhA,ackA-pta,poxB,mgsA,iclR)生長狀態(tài)近似于野生型，平均琥珀酸產(chǎn)率達(dá)到0.50mmolg CDW-1h-1。置換乙醛酸循環(huán)酶基因aceA,aceB啟動子為trc啟動子，對琥珀酸生產(chǎn)沒有影響。通過載體過表達(dá)乙醛酸循環(huán)酶基因，琥珀酸得率提高13.9％，但葡萄糖耗速率下降56.3%。過表達(dá)丙酮

4、酸羧化酶基因pyc有利于提高菌體生長速率、葡萄糖消耗速率和琥珀酸產(chǎn)率，該酶表達(dá)水平的差異對琥珀酸生產(chǎn)影響較大；共表達(dá)pyc和ppc，琥珀酸產(chǎn)量低于單表達(dá)pyc；共表達(dá)pyc和乙醛酸循環(huán)相關(guān)酶基因，琥珀酸產(chǎn)量高于單表達(dá)乙醛酸循環(huán)相關(guān)酶基因，但低于單表達(dá)pyc。經(jīng)發(fā)酵摸索分析，菌株ZJG13-1Y是所構(gòu)建菌株中琥珀酸生產(chǎn)速率最高的菌株。
　　對菌株ZJG13-1Y分批補(bǔ)料發(fā)酵，結(jié)果顯示琥珀酸積累量為36.6g/L，平均比琥珀酸產(chǎn)率為0