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1、5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA),是四吡咯類化合物(例如:亞鐵血紅素、卟啉、葉綠素和維生素B<,12>)的共同前體,也是調(diào)節(jié)四吡咯類物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵代謝中間物,廣泛存在于微生物、植物和動(dòng)物細(xì)胞中。近年來(lái),發(fā)現(xiàn)ALA在農(nóng)業(yè)上可用作殺蟲劑、除草劑、病毒病制劑及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子;在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,ALA作為第二代光動(dòng)力藥物,可用于治療各種癌癥,且副作用小、療效確切。因此對(duì)ALA的工業(yè)化生產(chǎn)引起了學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的重
2、視。 本文從嗜酸芽生紅細(xì)菌 Rhodoblastus acidophilus 中克隆得到了ALA合成酶基因,構(gòu)建了高產(chǎn)5-氨基乙酰丙酸的工程菌,通過(guò)對(duì)工程菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化,大幅度提高了ALA的產(chǎn)量。將胞外ALA應(yīng)用于作物,發(fā)現(xiàn)外源ALA能有效提高作物體內(nèi)葉綠素含量及干物質(zhì)重,同時(shí)提高了作物的抗逆性。 研究工作的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)和進(jìn)展包括: 1.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道R.acidophilus的ALAS基因(Genebank
3、 登勻之號(hào):DQ288861) 序列,設(shè)計(jì)分別帶有SacⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的上下游引物 ALAS-FOR和 ALAS-REV,克隆了大小為1267bp的ALAS目的基因片段;將目的基因與表達(dá)載體 pQE30 分別經(jīng) SacⅠ和 HindⅢ雙酶切后連接,構(gòu)成了原核表達(dá)載體ALAS-pQE30。將表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化E. coli JM109、M15和BL21(DE3)菌株,通過(guò)比較3個(gè)重組菌ALA合成酶比活力及積累ALA的能力,確定重組菌
4、E.coliM15 (ALAS-pQE30)為優(yōu)勢(shì)菌株。 2.以重組菌 E.coli M15(AIAS-pQE30)為研究對(duì)象,對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,包括誘導(dǎo)劑、底物及抑制劑的添加量、添加時(shí)間及添加方式,同時(shí)研究了間歇式的向搖瓶中補(bǔ)加培養(yǎng)基能增大胞外濃度,經(jīng)發(fā)酵放大的E.coli M15(ALAS-pQE30)過(guò)夜培養(yǎng)后胞外ALA積累量達(dá)到5.3791g·L<'-1>。 3.將發(fā)酵液采取高溫處理或SDS變性后,低溫保存
5、能降低ALA的降解。且1%SDS處理的效果最明顯,在-20℃保存時(shí),25d內(nèi)降解的ALA只有24%,4℃保存時(shí)也只降解29%。 4.用M15(ALAS-pQE30)發(fā)酵液上清處理煙草和辣椒,能有效提高體內(nèi)葉綠素含量,同時(shí)葉片的比葉重得到很大提高,即外源ALA能提高植物的光合作用質(zhì)量、增加作物產(chǎn)量。而且經(jīng)外源ALA處理后的煙草經(jīng)霜凍與干旱脅迫后,其體內(nèi)POD和CAT活性提高,而MDA含量降低,證明外源ALA能明顯提高煙草的抗逆性。
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