熱穩(wěn)定5-氨基乙酰丙酸合成酶的篩選、表達(dá)、酶學(xué)性質(zhì)研究及其應(yīng)用.pdf

1、5-氨基乙酰丙酸(簡(jiǎn)稱ALA)是生物合成四吡咯的前體，具有很高的附加值，在農(nóng)業(yè)與醫(yī)學(xué)上有著廣泛的應(yīng)用。5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS)是生產(chǎn)ALA的關(guān)鍵酶，所以對(duì)ALAS的研究得到了廣泛關(guān)注。本論文以建立體外多酶催化生產(chǎn)ALA的方法為目標(biāo)，通過篩選熱穩(wěn)定性良好的ALAS，將其在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)，然后對(duì)ALAS進(jìn)行了純化與酶學(xué)性質(zhì)的分析，最后利用熱穩(wěn)定性良好的ALAS在體外進(jìn)行ALA的生產(chǎn)。獲得了如下主要研究結(jié)果:

2、
　　對(duì)三個(gè)來源于耐熱菌的ALAS，包括GT-ALAS(ALAS來源于熱葡糖苷酶地芽孢桿菌)，LS-ALAS(ALAS來源于高溫放線糖萊斯菌)以及PA-ALAS(ALAS來源于嗜堿性假單胞菌)，以及來源于兩個(gè)做過研究的菌株，包括RP-ALAS(ALAS來源于沼澤紅假單胞菌)與RS-ALAS(ALAS來源于類球紅細(xì)菌)，在大腸桿菌中成功表達(dá)而且表達(dá)量很高，然后對(duì)這五個(gè)酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析。這五個(gè)酶的最適溫度與最適pH分別為37℃與

3、7.5。其中GT-ALAS，LS-ALAS，PA-ALAS的熱穩(wěn)定性良好，37℃條件下放置60h后酶活幾乎沒有降低，55℃條件下LS-ALAS放置3h后所剩酶活是最高的(43％)。LS-ALAS的比酶活在這五個(gè)酶之中最高(7.8U/mg)且對(duì)溫度與pH最不敏感。
　　選擇熱穩(wěn)定性良好且酶活最高的LS-ALAS，利用體外多酶催化的方法進(jìn)行ALA的生產(chǎn)。多酶催化轉(zhuǎn)化過程以琥珀酸，甘氨酸為底物，磷酸吡哆醛(PLP)作為輔因子，多聚磷酸鈉