嗜熱酯酶Est11的克隆表達、酶學性質及其在糖酯合成中的應用研究.pdf

1、酯酶（carboxylesterases，carboxyl ester hydrolases，EC3.1.1.1）可催化酯交換、酯合成、多肽合成和內酯合成等多種反應，在食品、化工和環(huán)保等領域發(fā)揮著重要作用。嗜熱酯酶與常溫酯酶相比，表現(xiàn)出較強的熱穩(wěn)定性和抗有機溶劑等性能，因此在生物催化合成等領域極具應用潛能。本研究首先將來自嗜熱古菌海棲熱胞菌MSB8（Thermotoga maritima MSB8）中表達酯酶的基因 Tm1350在大腸桿

2、菌中克隆表達，得到嗜熱酯酶Est11，然后對嗜熱酯酶Est11的酶學性質進行研究，最后對該嗜熱酯酶Est11在催化合成糖酯方面進行了探究。
　　具體實驗結果如下：
　　（1）生物信息學分析表明，T.maritima MSB8全基因組中Tm1350酯酶基因全長為780 bp，對應編碼259個氨基酸。利用Blast軟件找到氨基酸同源序列，并利用同源序列分析軟件Clustal W對其保守結構域和位點進行分析，結果發(fā)現(xiàn)Ser103、

3、Asp183和His249可能是Tm1350酯酶的催化活性中心。
　?。?）采用重疊 PCR方法克隆嗜熱酯酶基因 Tm1350，成功構建重組質粒pET15b-Tm1350，將重組質粒pET15b-Tm1350轉化至Escherichia.coli BL21感受態(tài)細胞中構建宿主工程菌，重組基因工程菌E.coli BL21經IPTG誘導能夠穩(wěn)定表達目的蛋白酶Est11，SDS-PAGE結果顯示該目的蛋白Est11分子量約28 KDa，

4、鎳柱親和層析純化法所得Est11純化回收率達到27.13％，Est11比活力為993.05 U/mg。
　?。?）嗜熱酯酶Est11的酶學性質研究表明：（a）酯酶Est11的最適作用溫度和最適pH分別為70℃和6.5。酯酶Est11具有較高的熱穩(wěn)定性，90℃高溫下處理5 h仍有60%以上的殘余酶活。（b）底物特異性分析表明嗜熱酯酶Est11適宜水解碳鏈長度小于10的對硝基苯酚酯，且其最適水解底物為pNP-C5。（c）0.5 mM金

5、屬陽離子螯合劑EDTA、Ba2+和Mg2+對嗜熱酯酶Est11酶活性無顯著影響；Na+和K+能將嗜熱酯酶Est11的酶活性提高約20%；Ni2+、Mn2+、Ca2+、Zn2+和Pb2+使嗜熱酯酶Est11酶活性降低約50%；Cu2+明顯抑制嗜熱酯酶Est11的酶活，使其酶活力僅剩14%；Al3+則完全抑制嗜熱酯酶Est11酶活性。（d）該嗜熱酯酶Est11具有較強的抵抗有機溶劑能力，Est11在90%的DMSO、甲醇、乙醇等有機溶劑體系

6、中處理2 h，酶活性無明顯變化，而在90%的叔戊醇、氯仿、二氯甲烷等有機溶劑體系中仍有約50%酶活。（e）嗜熱酯酶Est11在離子液體中酶活性降低，如在50%離子液體N-辛基-4-甲基吡啶四氟硼酸鹽中處理2 h酶活性僅剩60%。（f）SDS、Tween-20等對嗜熱酯酶Est11酶活性無顯著影響。5 mM DTT和PMSF使嗜熱酯酶Est11酶活性分別降為原來的13%和51%，5 mM DEPC則完全抑制Est11酶活性。（g）傅里葉紅