兩種新型嗜熱酯酶的克隆、表達及酶學性質研究.pdf

1、酯酶是一類水解含羧基酯鍵、酰胺鍵和硫酯鍵的內源性與外源性化合物的多功能酶,屬于絲氨酸水解酶家族。來源于微生物的酯酶能夠高效催化酯化、轉酯、酯交換以及光學活性物質的動力學拆分等反應,廣泛應用于石油開采、工業(yè)廢水處理、食品生產、環(huán)境保護、醫(yī)藥化工等多種領域。嗜熱酯酶指高溫下(最適反應溫度≥60℃)催化酯鍵水解、合成和交換反應的水解酶類,與中溫酯酶相比,嗜熱酯酶在熱穩(wěn)定性、對變性劑和有機溶劑抗性以及催化速率等方面具有獨特的優(yōu)勢,是近年來生物催

2、化領域研究的重點。
　　本文克隆、表達和純化了源于嗜熱菌海棲熱袍菌和硫化葉菌的新型酯酶EST10(Tm1160)和EstSt7(ST2026)。采用PCR技術擴增酯酶基因Tm1160和ST2026,克隆到載體pET15b中,構建重組載體pET15b-Tm1160和pET15b-ST2026;將重組載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中,經IPTG誘導表達目的蛋白。經熱處理、鎳柱親和層析和分子篩層析純化,得到純化的重組酯酶蛋白。SDS

3、-PAGE結果顯示,純化的酯酶EST10和EstSt7蛋白分子量分別為37.2KDa和39.4KDa。
　　分別對酯酶EST10(Tm1160)和EstSt7(ST2026)的酶學性質進行了詳細研究。分子篩和化學交聯(lián)實驗表明,酯酶EST10在水溶液中以二聚體形式存在。該酶最適反應溫度和pH分別為70℃和5.0-5.5;通過水解底物特異性和動力學實驗,發(fā)現(xiàn)酯酶EST10能夠水解短鏈脂肪酸(≤C10)形成的對硝基苯酚酯,最適底物為對硝

4、基苯基丁酸酯。酯酶EST10具有較強熱穩(wěn)定性和耐酸性,90℃半衰期為60min;在70℃和pH4.5環(huán)境下處理60min后,仍然保持約50％的活性。此外,該酶對有機溶劑(甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、丙酮、異丙醇、異戊醇、氯仿等)、表面活性劑(吐溫20、吐溫80、Triton-X100)和變性劑(SDS、DTT、尿素)等有較好的抗性。金屬離子Co2+、Cu2+和Fe2+對該酶活性有微弱的抑制作用。酯酶EST10能夠對酮洛芬乙酯進行高效選擇性

5、拆分,生成(S)-酮洛芬,具有一定的手性藥物生產應用前景。
　　通過分析酯酶EstSt7(ST2026)的氨基酸序列、系統(tǒng)發(fā)育樹和保守結構域,發(fā)現(xiàn)EstSt7及其同源蛋白不屬于已經報道的細菌酯酶/脂肪酶八大家族,而是形成一個新家族。酯酶EstSt7最適反應溫度為80℃,90℃條件下半衰期可達180min;最適反應pH為9.0,在pH8.0-10.0范圍內酶活保持80%以上,屬于堿性酯酶。底物特異性和動力學實驗表明該酶最適底物為硝基