草菇乙酰木聚糖酯酶的重組表達(dá)及其酶學(xué)特性.pdf

1、食用菌草菇中的乙酰木聚糖酯酶基因之前已被克隆出來。為了乙酰木聚糖酯酶能夠在畢赤酵母表達(dá)體系中高效表達(dá)，我們根據(jù)畢赤酵母偏愛密碼子，設(shè)計(jì)了26條寡核苷酸鏈，并通過PCR技術(shù)合成了乙酰木聚糖酯酶全基因。合成的乙酰木聚糖酯酶基因的cDNA(GenBank的編號(hào)為DQ888226)由349個(gè)氨基酸編碼構(gòu)成，長(zhǎng)度為1363bp，分子量為39，990 Da。而后重組乙酰木聚糖酯酶基因在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)了出來，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括通過兩種

2、不同培養(yǎng)基(BMMH和BMMY)，培養(yǎng)基中不同YNB的濃度，不同接種量，不同起始pH以及甲醇添加量，研究了這些不同培養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)酶表達(dá)的影響。酵母工程菌的最佳表達(dá)條件為：BMMY培養(yǎng)基，100％YNB，接種量為OD<,600>=30，起始pH為6.0，在甲醇濃度為1.0％時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)出的乙酰木聚糖酯酶的純化方法是用膠Ni-NTA Agarose進(jìn)行親和層析，后經(jīng)SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)純化的重組乙酰木聚糖酯酶出現(xiàn)了48 kDa和6

3、6 kDa兩條帶，用內(nèi)切糖苷酶endo H處理后，變成45kDa的一條帶。酶活的測(cè)定方法是以4-methylumbelliferyl acetate為底物，測(cè)定其反應(yīng)最初2分鐘的吸光值變化。酶活測(cè)定的最適條件為：pH 8.0，50℃。以4-methyl，umbelliferyl acetate為底物的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)為：Km=307.69μM， Vmax=769.23IU/μM。重組乙酰木聚糖酯酶有較廣泛的底物專一性，對(duì)底物acetyl x

4、vlan，tetra-acetate xylose和α-naphthyl acetate都有水解能力。其中對(duì)底物 tetra-acetate xvlose有著最高的特異性酶活(52450 IU/μmol)，對(duì)底物α-naphthyl acetate的活性較低，只有tetra-acetate xylose的1.8％。論文還對(duì)乙酰木聚糖酯酶的吸附性能作了研究，發(fā)現(xiàn)它對(duì)微晶纖維素(上清液剩余酶活下降為77.3％)和磷酸潤(rùn)漲纖維素(上清液剩余酶