2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、全世界每年會產(chǎn)生大約2000億噸的農(nóng)業(yè)廢棄物,是自然界最廣泛的木質(zhì)纖維素來源之一,包括農(nóng)作物秸稈、稻殼、甘蔗渣、玉米芯等。木質(zhì)纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,木聚糖是半纖維素中最豐富的一類。目前,對于半纖維素酶的生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究也主要集中在木聚糖降解酶。木聚糖酶是水解木聚糖為木糖的一類降解酶,由于其可降解木聚糖中的β-1,4糖苷鍵,既可降低木聚糖的粘性和抗?fàn)I養(yǎng)性,又可產(chǎn)生具有保健和調(diào)節(jié)胃腸功能的低聚木糖,已廣泛應(yīng)用于食品

2、、飼料、醫(yī)藥、造紙、紡織等行業(yè)。木聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了其降解需要多種木聚糖酶的協(xié)同作用,包括水解主鏈的內(nèi)切木聚糖酶、木糖苷酶以及水解側(cè)鏈的一些酯酶等。由于天然木質(zhì)纖維素底物的復(fù)雜性,這些木聚糖降解酶系之間如何通過協(xié)同作用實現(xiàn)木聚糖的完全水解,其中的機(jī)理目前尚不清楚。
  實驗室從高溫堆肥樣品中篩選得到一株高效纖維素降解真菌A.fumigatus Z5,以木聚糖為唯一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵,通過RT-PCR、質(zhì)譜分析等獲得了幾個主要的木

3、聚糖降解相關(guān)基因,包括4個內(nèi)切木聚糖酶基因(Y699_04481,06333,07611,09486),2個木聚糖苷酶基因(Y699_04570,05610)和1個乙酰木聚糖酯酶基因(Y699_05457)。本研究旨在實現(xiàn)這些木聚糖酶基因在黑曲霉AB1.13和畢赤酵母X33中的高效異源表達(dá),同時對Afumigatus Z5中不同內(nèi)切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶在木聚糖降解中的協(xié)同作用進(jìn)行研究,主要研究結(jié)果如下:
  (1)對木聚糖酶基

4、因絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過程中表達(dá)載體的構(gòu)建、原生質(zhì)體的制備以及轉(zhuǎn)化效率的提高進(jìn)行了初步探索,獲得了黑曲霉原生質(zhì)體的制備條件:菌絲體培養(yǎng)24 h,使用復(fù)配酶(蝸牛酶(100 mg/mL)+溶壁酶(100U/mL))酶解2~2.5 h。
  (2)在畢赤酵母X33內(nèi)成功地表達(dá)了來源于A.fumigatus Z5的一個GH10家族的β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因Y699_09486和一個具有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列(cbm_1)的乙酰木聚

5、糖酯酶基因Y699_05457,對應(yīng)的表達(dá)蛋白分別命名為Xyn10C和AXE1。Xyn10C轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液酶活為83.08IU/mL,最適反應(yīng)條件為70℃,pH5.0-6.0,60℃處理1h后酶活仍保持在95%以上。乙酰木聚糖酯酶AXE1轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液酶活達(dá)到84.76IU/mL,最適反應(yīng)條件為55-60℃,pH7.0-7.5,60℃處理1h后酶活保持在70%以上。
  (3)將來源于A.fumigatus Z5的一個GH10家族的多

6、結(jié)構(gòu)域內(nèi)切木聚糖酶基因Y699_04481的cbm_1序列及其多絲氨酸連接序列(linker)連接在另一個GH10家族的單結(jié)構(gòu)域β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶基因Y699_06333(對應(yīng)的異源表達(dá)蛋白為Xyn10B)的C端,并在畢赤酵母X33內(nèi)成功地進(jìn)行了融合表達(dá)。比較了Xyn10B和融合蛋白Xyn10BaLC的酶學(xué)性質(zhì)差異,同時對Xyn10BaLC的CBM功能進(jìn)行測定。結(jié)果表明,CBM的存在不會影響Xyn10B的酶學(xué)性質(zhì),但是Xyn10B

7、aLC對燕麥木聚糖的催化效率(Kcat/Km)明顯降低,由Xyn10B的22.42 s-1 mg-1 ml-1降低至4.57 s-1mg-1 ml-1。
  (4)研究了不同的內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C、Xyn10B和Xyn10BaLC對水洗玉米芯粉末(the washed corncob powder,WCCP)以及經(jīng)高溫高壓處理的WCCP的降解效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),同屬于GH10家族的單結(jié)構(gòu)域內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C和Xyn10B,對

8、于水洗玉米芯粉末(WCCP)幾乎無降解產(chǎn)還原糖能力,而帶有CBM的Xyn10BaLC則能夠降解WCCP產(chǎn)還原糖;對于經(jīng)高溫高壓處理后的WCCP,Xyn10BaLC降解產(chǎn)還原糖量增加,Xyn10C和Xyn10B也表現(xiàn)出了降解產(chǎn)還原糖能力,且Xyn10B較Xyn10C能夠產(chǎn)生更多的還原糖。從上述降解效果來看,CBM的存在使得內(nèi)切木聚糖酶具備了降解天然不可溶木聚糖底物的能力,而底物的預(yù)處理會破壞不可溶木聚糖底物的結(jié)構(gòu),從而使不攜帶CBM的內(nèi)切

9、木聚糖酶表現(xiàn)出降解能力,由此推測,同屬于GH10家族且都為單結(jié)構(gòu)域酶的內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C和Xyn10B,在催化效率上會存在有不同的差異,這可能是燕麥木聚糖誘導(dǎo)的A.fumigatus Z5中Xyn10C和Xyn10B對應(yīng)的基因都有高轉(zhuǎn)錄但是質(zhì)譜分析卻檢測不到Xyn10C的原因。
  (5)研究了不同的內(nèi)切木聚糖酶Xyn10C、Xyn10B和Xyn10BaLC和乙酰木聚糖酯酶AXE1對水洗玉米芯粉末(WCCP)的協(xié)同降解效果,

10、結(jié)果只有Xyn10BaLC和AXE1表現(xiàn)出了對WCCP的協(xié)同效應(yīng)。這可能是由于Xyn10BaLC和AXE1兩個酶均有CBM_1的存在,從而會引導(dǎo)它們趨向玉米芯中同一區(qū)域的木聚糖底物,因此表現(xiàn)出協(xié)同降解效果,即存在“協(xié)同效應(yīng)區(qū)域化”。這一結(jié)果說明,對于復(fù)雜的天然固體木聚糖底物,CBM的存在,除了在內(nèi)切木聚糖酶降解不可溶木聚糖底物過程中有很重要的作用,在內(nèi)切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶的協(xié)同作用中同樣占有至關(guān)重要的地位。
  (6)研究了

11、玉米芯水洗程度及機(jī)械粉碎程度對于木聚糖酶降解效果的影響。分別以水洗玉米芯粉末(WCCP)和未水洗玉米芯粉末以及不同顆粒大小的玉米芯作底物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),類似于經(jīng)高溫高壓預(yù)處理的玉米芯,內(nèi)切木聚糖酶Xyn10B、Xyn10BaLC、Xyn10C均能夠降解未水洗的玉米芯粉末產(chǎn)還原糖,但是Xyn10BaLC與AXE1則不再表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng);此外,無論是水洗還是未水洗,玉米芯顆粒越小,酶解產(chǎn)生的還原糖總量越多。Xyn10B、Xyn10C能夠降解未水洗

12、的玉米芯產(chǎn)還原糖,可能的原因是未水洗的玉米芯表面有足夠多的可溶性的、易接觸的木聚糖,這些木聚糖底物可被Xyn10B、Xyn10C直接作用,因此表現(xiàn)出了降解能力;同樣的,Xyn10BaLC的催化中心也會作用于這些可溶性的、易接觸的木聚糖,這樣就降低了Xyn10BaLC和AXE1通過CBM_1與纖維素的結(jié)合對同一特定區(qū)域木聚糖底物的導(dǎo)向性,因此協(xié)同效率降低。不同的內(nèi)切木聚糖酶通過作用于玉米芯不同區(qū)域的木聚糖共同發(fā)揮水解作用,可能是A.fum

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