結(jié)核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶的克隆表達(dá)及其性質(zhì)研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌是人類死亡的頭號殺手，嚴(yán)重影響著人類健康。隨著廣譜耐藥性的出現(xiàn)，其威脅將越來越嚴(yán)峻，開發(fā)新的結(jié)核病治療靶標(biāo)迫在眉睫。結(jié)核分枝桿菌的新陳代謝必須適應(yīng)胞內(nèi)環(huán)境才可能在人巨噬細(xì)胞中生存，然而人類對于結(jié)核分枝桿菌在宿主細(xì)胞和組織的生存過程中的代謝相關(guān)知識了解甚少，尤其是核心的中間物代謝。檸檬酸循環(huán)是新陳代謝的中心環(huán)節(jié)。它既是絕大多數(shù)生物體主要的分解代謝途徑，也是準(zhǔn)備提供大量自由能的重要代謝系統(tǒng)，在合成代謝中都以該循環(huán)的中間產(chǎn)物為生物

2、合成的前體來源。琥珀酰輔酶A合成酶(succinyl-CoA synthetase，SCS)(EC 6.2.1.5)是檸檬酸循環(huán)的重要組成成分，催化該循環(huán)中唯一發(fā)生底物水平磷酸化的步驟，這一反應(yīng)是可逆的：琥珀酰輔酶A+NDP+P(i) 盤琥珀酸鹽+CoA+NTP(N指代腺苷酸或鳥苷酸)。SCS由α和β兩種亞基構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究，利用雙向電泳技術(shù)對貓爪草提取物作用前后的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的全細(xì)胞蛋白表達(dá)圖譜進(jìn)行差異比較和分析，發(fā)

3、現(xiàn)琥珀酰輔酶A合成酶的編碼基因(Rv0951)在貓爪草作用后其表達(dá)明顯下調(diào)。本文在此基礎(chǔ)上展開研究，以期這部分工作能有助于結(jié)核病治療靶標(biāo)的開發(fā)。 本研究用PCR技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌基因組DNA中擴(kuò)增了編碼琥珀酰輔酶A合成酶α和β亞基的兩個基因(SucD和SucC)，其大小分別為1000 bp和1200 bp左右。將PCR產(chǎn)物分別連入載體pET28a(+)和pET32a(+)中，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明成功

4、構(gòu)建了重組質(zhì)粒pSCSa-pET28和pSCSp-pET32。 pET28a(+)和pET32a(+)分別帶有卡那霉素抗性標(biāo)記和氨芐青霉素抗性標(biāo)記，兩重組質(zhì)粒便具有了相應(yīng)的篩選標(biāo)記。兩重組質(zhì)粒分別或同時轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后均可見重組蛋白可溶形式的表達(dá)。重組菌經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后，離心收集菌體，超聲波破碎，取上清進(jìn)行親和純化。純化后的蛋白用于圓二色譜和酶活分析。 用圓二色譜儀分析重組蛋白的二級結(jié)構(gòu)，將其與在

5、線軟件(http：//www.Predictprotein.org)預(yù)測的結(jié)核分枝桿菌SCSa和SCSp的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較。SCS的生物學(xué)活性結(jié)構(gòu)存在兩種不同的形式：哺乳動物線粒體的SCS僅僅以αβ二聚體發(fā)揮功能，大腸桿菌中則以(αβ)<,2>四聚體的形式發(fā)揮活性。本文以大腸桿菌SCSa和SCSp的晶體結(jié)構(gòu)作為模板探討了結(jié)核分枝桿菌SCSa和SCSB的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)這兩個物種的SCSa和SCSp結(jié)構(gòu)都非常相似，推測結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮其生物學(xué)

6、功能的SCS結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的一致。酶活分析表明共轉(zhuǎn)pSCSa-pET28和pSCSβ-pET32的重組菌的純化蛋白具有SCS的催化活性，即：將琥珀酸鹽和CoA轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。 由于SCS催化琥珀酸輔酶A與琥珀酸的相互轉(zhuǎn)化是一個可逆過程，極易向正反兩個方向進(jìn)行。本文用HPLC探討了SCS兩個亞基不同的表達(dá)水平對宿主產(chǎn)生琥珀酸的影響，所用菌株為：①表達(dá)宿主菌BL21(DE3)；②表達(dá)pET28a(+)載體蛋白的BL21(DE3)

7、；③表達(dá)pET32a㈩載體蛋白的BL21(DE3)；④表達(dá)SCSa融合蛋白的BL21(DE3)；⑤表達(dá)SCSβ融合蛋白的BL21(DE3)；⑥同時表達(dá)SCSa融合蛋白和SCSβ融合蛋白的BL21(DE3)。發(fā)現(xiàn)①②③誘導(dǎo)前后琥珀酸的含量都較高(10 g/L～20 g/L)；④⑤⑥誘導(dǎo)前后琥珀酸的含量都較低(0.48g/L～10 g/L)，其中④經(jīng)誘導(dǎo)后琥珀酸的產(chǎn)量為誘導(dǎo)前的5～17倍，⑤經(jīng)誘導(dǎo)后琥珀酸的產(chǎn)量為誘導(dǎo)前的0.9～3.9倍，⑥

8、經(jīng)誘導(dǎo)后琥珀酸的產(chǎn)量為誘導(dǎo)前的0.56～1.09倍。說明SCS的任何一個亞基的過量表達(dá)都有助于琥珀酸的積累，而兩個亞基都同時過量表達(dá)卻有利于琥珀酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。琥珀酰輔酶A為許多化合物合成的重要中間產(chǎn)物，它還參與厭氧菌特有的烴類降解的代謝過程中的第六步：苯甲酰琥珀酰輔酶A分解成苯甲酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，后者又參與第二步反應(yīng)把輔酶A轉(zhuǎn)移到苯甲酰琥珀酸上，形成循環(huán)。潛伏期結(jié)核菌可能啟動類似的代謝機(jī)制應(yīng)對低氧或缺氧環(huán)境，但目前尚未見相