結(jié)核分枝桿菌H27Rv色氨酸合成酶α和β亞基的酶學性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、結(jié)核病是全球死亡率和發(fā)病率最高的傳染性疾病之一,每年可以引起8百萬人感染,導致2.5-3百萬人死亡。結(jié)核分枝桿菌是引起人類結(jié)核病的致病菌。全球耐多藥結(jié)核菌的出現(xiàn)和蔓延,對發(fā)展新型的抗結(jié)核藥物提出了迫切需求。
　　 色氨酸合成途徑不存在于哺乳動物中。然而,對于藻類、細菌、真菌和高等植物,它們必須自行合成色氨酸。結(jié)核桿菌的色氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株不能在巨噬細胞里繁殖和存活,證明該代謝途徑對結(jié)核桿菌的存活至關(guān)重要。這種高度選擇性使得色氨酸

2、合成途徑中的酶成為可能的開發(fā)有效抗結(jié)核藥物的藥靶。
　　 色氨酸生物合成途徑是從分支酸起始的五步連續(xù)反應。色氨酸合成酶(TSase)催化色氨酸合成途徑中的最后兩步反應。色氨酸合成酶是具有αββα亞基結(jié)構(gòu)的異質(zhì)四聚體,其中α,β亞基分別由trpA和trpB基因編碼。β亞基酶蛋白以吲哚和L-絲氨酸為底物,酶促合成L-色氨酸。其中,PLP(pyridoxal-5'-phosphate)是輔因子。
　　 本論文克隆了色氨酸合成酶

3、α和β亞基的編碼基因Rv1613和Rv1612(即trpA和trpB),然后在大腸桿菌中BL21(DE3)得到表達,通過親和純化獲得高純的重組蛋白,SDS-PAGE和質(zhì)譜結(jié)果顯示它們的MW分別為33151.0u和50224.0u(含載體蛋白),證實確為重組目的蛋白。通過優(yōu)化實驗,得到β亞基酶反應最佳條件為:0.15MNa+或0.18M Mg2+,PH7.5,溫度37℃,His-rMtTRPSA與His-rMtTRPSB的摩爾比為2.2。

4、同時,也證實了色氨酸合成酶α亞基可以促進β亞基酶活反應。在此反應條件下,色氨酸合成酶β亞基對底物吲哚,L-絲氨酸和PLP的Km值分別為0.288mM,0.178mM和20.824Mm。通過圓二色儀獲得色氨酸合成酶α和β亞基的二級結(jié)構(gòu),再采用同源模建方法建立了兩亞基的結(jié)構(gòu)模型,結(jié)構(gòu)比較預測色氨酸合成酶β亞基中PLP的結(jié)合位點(活性中心)為Ser390,Ser99,Gln128,Ser249,Asn250,Glu364,Thr204,His