結(jié)核分枝桿菌葡糖胺-6-磷酸合成酶的克隆表達(dá)及其性質(zhì)研究.pdf

1、結(jié)核病，真菌、細(xì)菌感染及糖尿病等世界流行病在不斷的威脅著人類的健康。結(jié)核病是嚴(yán)重威脅人類健康的頭號殺手，隨著AIDS與結(jié)核病的共患以及耐多藥結(jié)核病例的增多，迫切需要開發(fā)新的治療結(jié)核病的分子靶標(biāo)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)在不斷發(fā)展，新藥物的不斷產(chǎn)生，但是細(xì)菌性感染和真菌感染的發(fā)病率也呈上升趨勢，并隨之產(chǎn)生了耐藥株，也迫切需要開發(fā)低毒并能對付耐藥性和多重抗藥性致病菌的抗生素。隨著人們生活水平的提高，一些富貴病也隨之產(chǎn)生，如高血糖引起的糖尿病及其慢性

2、并發(fā)癥肥胖、高胰島素血癥、高脂血癥和高瘦素血癥等“胰島素抵抗綜合癥”。由于這些疾病可危及生命而成為世界醫(yī)學(xué)三大疑難病之一。因此開發(fā)治療糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的分子靶標(biāo)和藥物也迫在眉睫。 葡糖胺-6-磷酸合成酶催化D-果糖-6-磷酸和L-谷氨酰胺生成葡糖胺-6-磷酸和谷氨酸，是氨基己糖(己糖胺，HBP)代謝和細(xì)胞壁合成反應(yīng)的第一步反應(yīng)，該途徑的終產(chǎn)物N-乙酰葡糖胺是細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁構(gòu)建的基本模塊。細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖、脂多糖的基本成分是

3、N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺。真菌、昆蟲和甲殼類動物的幾丁質(zhì)，哺乳動物的糖蛋白、黏多糖都是通過N-乙酰葡糖胺最終合成的。哺乳動物細(xì)胞中，葡糖胺-6-磷酸合成酶控制著葡萄糖到己糖胺途徑的流量，催化糖蛋白和糖脂生成必須的底物，在葡萄糖平衡調(diào)節(jié)中起著重要的作用。葡糖胺-6-磷酸合成酶也是一個胰島素調(diào)節(jié)酶，介導(dǎo)Ⅱ型糖尿病的胰島素抵抗。由于各種生物的葡糖胺-6-磷酸合成酶的功能活性位點高度保守，因此葡糖胺-6-磷酸合成酶被認(rèn)為是開發(fā)抗細(xì)菌、抗

4、真菌、治療Ⅱ型糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥等疾病的抗生素的分子靶標(biāo)。 本研究利用體外擴增技術(shù)從結(jié)核分枝桿菌基因組中擴增了葡糖胺-6-磷酸合成酶基因，其大小約為1，900bp。將PCR產(chǎn)物連入載體pET32a(+)中，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET32-glmS。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生了重組蛋白質(zhì)。由于過表達(dá)該重組蛋白使宿主菌細(xì)胞壁更加耐受外界的機械損傷

5、，因此我們研究了過表達(dá)該酶對宿主菌的影響，包括：①過表達(dá)葡糖胺-6-磷酸合酶對宿主菌生長的影響；②過表達(dá)葡糖胺-6-磷酸合酶對宿主菌細(xì)胞壁的影響；③過表達(dá)葡糖胺-15-磷酸合酶對宿主菌抵抗萬古霉素的實驗；④過表達(dá)葡糖胺-6-磷酸合酶對宿主菌細(xì)胞壁完整性的影響。實驗結(jié)果表明異源表達(dá)結(jié)核分枝桿菌的glmS基因加速宿主菌的生長，影響細(xì)胞壁的形成和完整性。通過加入一定量的表面活性劑SDS，超聲波破碎細(xì)胞，Ni親和層析純化重組蛋白。由于表面活性劑