結(jié)核分桿桿菌NAD生物合成酶NaMNAT(Rv2421c)的分子伴侶功能.pdf

1、結(jié)核病疫情在世界范圍內(nèi)的急劇惡化已引起全球廣泛關(guān)注。全球近1/3的人口感染過(guò)結(jié)核菌。更嚴(yán)重的是對(duì)一線藥物(異煙肼(Isoniazidum)、利福平(Rifampin)、鏈霉素(Sstreptomycin)和乙胺丁醇(Eethambatal))甚至二線藥物(乙硫異煙胺(Ethionamide)/丙硫異煙胺(Protionamide)、環(huán)絲氨酸(Cycloserine)、對(duì)氨基水楊酸(P-aminosalicylic acid))的耐受的菌

2、株層出不窮。致使人類的健康水平受到嚴(yán)重的威脅。因此，尋找更有效的藥物來(lái)治療這個(gè)頑固性疾病是擺在醫(yī)藥工作者面前的重要課題。輔因子的生物合成途徑是一個(gè)豐富的潛在藥物靶標(biāo)資源庫(kù)。其中NAD是生物體中廣泛存在且必須的輔因子。NAD參與許多氧化還原反應(yīng)，能量代謝，活細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)，蛋白翻譯后的修飾，細(xì)胞凋亡，DNA修復(fù)，端粒的保護(hù)，基因沉默，細(xì)胞壽命，內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，免疫應(yīng)答和鈣離子信號(hào)通路，NAD還是VB12的合成的前體物等重要的生物過(guò)程。我們利用基

3、因組對(duì)比分析和子系統(tǒng)注釋工具，憑借SEED基因操作平臺(tái)(http：//theseed.uchicago.edu/FIG/index.cgi)，重新構(gòu)建了NAD在生物界中的合成途徑。到目前為止主要有六條途徑，分別是De novopathway(Try)，NmR pathway(NRK-依賴型)，NmR pathway(NRK-非依賴型)，Niacinrecycling。因此，研究NAD生物合成代謝的關(guān)鍵且保守的酶，并作為開發(fā)研制新型的抗結(jié)

4、核病的藥物靶標(biāo)具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。其中Mycobacterium tuberculosis擁有的是De novo pathway(Asp)和Niacin salavage兩條途徑，而NaNMAT，NADS，NADK是存在于M.tuberculosis兩條NAD生物合成途徑中的三個(gè)關(guān)鍵酶，因此是備受關(guān)注的潛在藥物靶標(biāo)。
　　 本研究主要對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD(Rv2421c)的克隆、表達(dá)及活性研究，

5、并利用生物信息學(xué)對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的分析及預(yù)測(cè)。從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的NaNMAT基因nadD的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以結(jié)核分枝桿菌H37Rv全基因組為模板，體外擴(kuò)增獲得nadD基因。通過(guò)TA克隆，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T SimpleVector，然后亞克隆至載體pET28a(+)中，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測(cè)定證明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28-nadD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿

6、菌(Escherichia coli)BL21(DE3)對(duì)該重組蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)，Ni+凝膠親和層析方法純化獲得高純度的重組NaNMAT。我們還將克隆出來(lái)的Rv2421c通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌和恥垢分枝桿菌之間的穿梭質(zhì)粒pMV261的重組質(zhì)粒，來(lái)研究過(guò)表達(dá)該酶對(duì)宿主菌的影響，重組NaNMAT恥垢分支桿菌的宿主菌對(duì)氧化壓力，紫外線照射，酸，堿，SDS，CuSO4等外界壓力條件的耐受性均增強(qiáng)。我們?cè)隗w外利用胰島素的凝集實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)NaNMA工具有分子