調控ATP和NADH-NAD+比例提高大腸桿菌琥珀酸的合成.pdf

1、琥珀酸是一種重要的平臺化合物，由于琥珀酸具有很大的應用潛力，它被認定為最重要的生物基大宗化學品之一。在大腸桿菌中提高琥珀酸合成的方法包括:阻斷競爭性途徑、激活乙醛酸支路、過表達琥珀酸生產的關鍵酶以及提高能量和還原當量的供應等。本實驗室已經構建了一系列產琥珀酸大腸桿菌，本文首次通過底物比例的調整，以及呼吸鏈的改造、ATP無效循環(huán)等一系列策略來調節(jié)菌株胞內ATP的產生和NADH/NAD+比例，達到提高琥珀酸產量和產率的目的。
　　葡萄

2、糖和木糖是纖維素水解液的主要成分，我們構建的產琥珀酸大腸桿菌YL104H可以以葡萄糖為底物高效的生產琥珀酸。進一步的研究發(fā)現YL104H也可以利用葡萄糖和木糖的混合糖來生產琥珀酸。然而，在發(fā)酵的厭氧階段以單一的木糖為底物時YL104H菌株不能積累琥珀酸，我們推測可能是由于以木糖作為底物時厭氧生產能量供應不足導致的。通過分析以單一葡萄糖或單一木糖為底物時厭氧階段ATP的產生情況。我們發(fā)現胞內ATP的水平會影響琥珀酸的產量，通過簡單的調節(jié)底

3、物中葡萄糖與木糖的比例就可以起到調節(jié)菌株胞內ATP水平的作用。之前的研究都是通過增加ATP的供應來提高琥珀酸的產量，本研究首次通過調控胞內ATP的產生達到最優(yōu)水平，以此來提高琥珀酸生產。YL104H菌株以不同比例的混合糖的發(fā)酵生產琥珀酸，發(fā)現當葡萄糖與木糖的比例為1∶2的時候琥珀酸產量最高。接著我們利用人工調配的最佳葡萄糖與木糖的比例進行發(fā)酵優(yōu)化，發(fā)現琥珀酸的產量可以達到一個比較高的水平。最后我們以木糖醇生產過程中得到的木糖廢液作為發(fā)酵

4、底物，YL104H菌株的琥珀酸產量達到61.66 g/L，全階段的琥珀酸生產力為0.95 g/L/h。
　　實驗室已構建的產琥珀酸工程菌株YL104也可以利用葡萄糖高效的生產琥珀酸，但全階段琥珀酸產率仍有待提高。在本研究中，我們探究了以葡萄糖為底物時菌株胞內NADH/NAD+比例、ATP水平和全階段琥珀酸產率三者之間的關系。首先通過代謝工程改造使YL104菌株在有氧和厭氧階段均使用厭氧NADH脫氫酶，改造后的工程菌株全階段琥珀酸產

5、率提高了7％。為了進一步降低轉厭氧時菌株胞內的NADH/NAD+比例，我們在YL104N菌株中異源表達來自釀酒酵母胞質可溶的延胡索酸還原酶FRDS，得到的工程菌株全階段琥珀酸產率提高了13％，菌株厭氧胞內的NADH/NAD+比例與ATP水平都有所下降。我們還在厭氧階段采用ATP無效循環(huán)策略使菌株YL104NP厭氧琥珀酸產量有了明顯提高，全階段琥珀酸產率提高了17％。同時采用過表達異源的FRDS和ATP無效循環(huán)策略，菌株全階段琥珀酸產率達