分子改造方法提高大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、酶具有反應活性高、專一性強、反應條件溫和的特點，因而被廣泛應用于工業(yè)和醫(yī)藥領域。但是它自身穩(wěn)定性差和來源有限等缺點，限制了它進一步的開發(fā)和利用，所以需對天然酶分子改造，以滿足實際應用的需要。目前通過分子改造來改善酶的性質是生物技術研究的一個熱點方向。
　　 天冬氨酸轉氨酶是一類廣泛存在于生物細胞內(nèi)的轉氨酶，在氮代謝中起到非常重要的作用。它可催化轉化底物苯丙酮酸生產(chǎn)重要的醫(yī)藥、食品工業(yè)原料-L-苯丙氨酸。在生產(chǎn)L-苯丙氨酸的工藝中

2、，如能提高反應溫度，則可增加底物苯丙酮酸的溶解度、加快草酰乙酸的分解進而顯著提高L.苯丙氨酸的得率。而天冬氨酸轉氨酶無法在較高溫度的條件下反應，是當前工業(yè)生產(chǎn)L-苯丙氨酸的瓶頸之一。
　　 大腸桿菌和嗜熱菌天冬氨酸轉氨酶的結構比較顯示了兩者在酶分子表面、酶亞基之間和酶整體結構上的明顯差異。本文從上述三個方面的結構差異與酶熱穩(wěn)定性間的關聯(lián)出發(fā)，分別建立了合理設計方法，半合理設計方法和定向進化方法對天冬氨酸轉氨酶分子進行改造，獲得了

3、5種耐熱性提高的天冬氨酸轉氨酶，初步建立了酶分子改造的技術平臺。本文的主要內(nèi)容包括3個方面。
　　 (1)采用合理設計方法改造天冬氨酸轉氨酶
　　 本文分析了大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶表面loop環(huán)上氨基酸組成的特點，比較了大腸桿菌和嗜熱菌天冬氨酸轉氨酶的組成，選擇了酶分子表面的疏水氨基酸L233和F350進行L233N和F350K的定點突變。在55℃條件下初始酶的半衰期為140min，疏水氨基酸L233替換成親水氨基酸N2

4、33后，形成的突變酶Enz N233的半衰期則延長至180min，疏水氨基酸F350替換成親水氨基酸K350后，形成的突變酶Enz K350的半衰期則降低至30min。這些研究工作采用突變大腸桿菌天冬氨酸轉氨酶分子表面loop環(huán)上疏水氨基酸的方法，從而建立起一種獲得熱穩(wěn)定性AspAT的簡易方法。
　　 (2)采用半合理設計改造天冬氨酸轉氨酶
　　 分析了天冬氨酸轉氨酶亞基的結構、亞基間的相互作用與酶熱穩(wěn)定性的關系，選擇了

5、位于亞基之間的殘基--19、T10、A12、R282、S285和Q286作為隨機突變的位點，構建了天冬氨酸轉氨酶的基因突變庫。從構建的突變文庫4000株突變菌中獲得了4種耐熱性明顯提高的突變酶(C1、C2、C3和C4)。這些突變酶在55℃條件下的半衰期都在840min以上，其中一種突變酶在37℃下的催化活性為野生型酶的87.9％。這些研究工作將合理設計方法和分子定向進化方法結合起來，從而建立起一種增強天冬氨酸轉氨酶亞基間作用力來提高酶熱

6、穩(wěn)定性的方法。
　　 (3)采用定向進化改造天冬氨酸轉氨酶分子的初步探索
　　 根據(jù)現(xiàn)有的天冬氨酸轉氨酶家族基因aspC和tyrB序列同源性不高的特點，結合限制性內(nèi)切酶的酶切片段間同源重組和非同源隨機重組過程，構建了突變文庫。通過選擇不同酶切片段的組合，使酶切的位點處于基因aspC和tyrB同源性高的14個區(qū)域內(nèi)，且不同酶切位點間距離大于20bp，使最終突變文庫中的基因重組幾率高達66％。通過控制酶切片段在PCR重組時的

7、退火溫度和反應循環(huán)數(shù)，適當?shù)卦黾踊蚱伍g的非同源隨機重組，提高了突變庫的突變率。測序結果表明，突變庫中的重組基因除含有aspC和tyrB基因間的片段交換。這些天冬氨酸轉氨酶突變文庫的研究工作可為該酶進行功能改良或新功能的進化提供新的酶源，同時也為進一步完善酶分子改造的技術平臺進行了有益的探索。
　　 本文的研究工作首次用酶改造的方法提高了天冬氨酸轉氨酶的熱穩(wěn)定性，獲得了5種熱穩(wěn)定性提高的天冬氨酸轉氨酶，并對建立該酶分子改造的技

8、術平臺進行了系統(tǒng)的探索。
　　 (1)本文提出并建立了基于亞基間相互作用來選擇定位隨機突變位點的半合理設計方法。此方法有效實現(xiàn)了天冬氨酸轉氨酶分子的改造工作，所獲得的4種突變酶在55℃下的半衰期比初始酶延長5.6倍，其中一種熱穩(wěn)定性最高的酶(C5)在60℃下的半衰期比初始酶延長16倍。4種突變酶和初始酶的結構比較發(fā)現(xiàn)，突變酶的突變殘基，或者形成氫鍵網(wǎng)絡結構(例如在突變酶C5、C12中)，或者通過色氨酸殘基的疏水環(huán)來增強了殘基間的

9、疏水作用(例如在突變酶C2、C4、C5中)。這些作用的增強提高了亞基間的結合力，從而提高酶的熱穩(wěn)定性。另外分析突變酶的結構還發(fā)現(xiàn)，酶表面的殘基發(fā)生突變后，會引起酶活性中心殘基W140、N297*、R292和R386與底物距離產(chǎn)生變化，造成了酶與底物間結合作用力發(fā)生改變，從而導致了突變酶對底物親和能力發(fā)生變化。
　　 (2)本文針對天冬氨酸轉氨酶分子表面的結構特點，建立了一種定點突變改造天冬氨酸轉氨酶分子的簡易方法。這個方法可根據(jù)

10、熱穩(wěn)定性不同酶中氨基酸殘基組成的差異來設計定點突變的路線。分析獲得的突變酶Enz N233的結構發(fā)現(xiàn)，酶表面loop上氨基酸殘基N233的親水性增加是酶熱穩(wěn)定性提高的主要原因，突變殘基N233和鄰近α-螺旋上殘基E320間相互作用的增強，也可能是酶耐熱性提高的原因之一；酶定點突變后還獲得了一個熱穩(wěn)定性降低的反例一突變酶Enz K350，對其結構分析發(fā)現(xiàn)，鄰近突變殘基周圍，若有電性相同的氨基酸殘基，將可能突變殘基排斥到酶分子的內(nèi)部，造成了

11、酶熱穩(wěn)定性的下降。
　　 (3)本文還結合同源重組和非同源隨機重組，探索了定向進化中突變文庫的構建方法。這個方法在酶切片段的同源重組中，增加了非同源隨機重組的過程，即克服了基因間同源區(qū)較少而造成同源重組突變率較低的局限，又保留了酶切片段在同源重組中重組幾率高的優(yōu)點。通過控制重組PCR的條件(退火溫度和PCR循環(huán)數(shù))，可以優(yōu)化突變庫中的突變率，增大獲得較優(yōu)突變體的可能性；對酶切片段的選擇，又提高了突變后基因的重組幾率，有利于減少后