計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、酶作為天然的生物催化劑,具有高催化效率和高底物選擇特異性的特點(diǎn),在工業(yè)生產(chǎn)上擁有巨大的應(yīng)用潛力和良好的發(fā)展前景。但是許多酶分子對工業(yè)生產(chǎn)中熱處理的耐受性較差,嚴(yán)重制約了它們在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。因此研究蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定機(jī)制與通過理性設(shè)計(jì)提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性一直是計(jì)算生物學(xué)及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)。這對擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍與探究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系均具有重要意義。
　　 本研究中我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)策略分別從微觀與宏觀兩方面分析確定了

2、影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸,并以來源于Ochrobactrum sp.M231的甲基對硫磷水解酶(MPH-Ochr)為研究對象,利用實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證設(shè)計(jì)策略的有效性。
　　 策略一為創(chuàng)新性的將分子動力學(xué)模擬應(yīng)用到蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究中。其計(jì)算步驟主要包括首先利用分子動力學(xué)模擬來尋找蛋白質(zhì)活性中心以外的構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)段,查找構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)段內(nèi)部或其附近的柔性氨基酸(如甘氨酸),并將這些柔性氨基酸突變?yōu)閯傂园被?如脯氨酸),再利用分子動

3、力學(xué)模擬來驗(yàn)證這些突變對構(gòu)象不穩(wěn)定區(qū)段的影響,即對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響。將該策略應(yīng)用到MPH—Ochr,首先通過分子動力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn)在該酶的第186-193位氨基酸的構(gòu)象非常不穩(wěn)定,并且這些氨基酸不在蛋白質(zhì)的活性中心,經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)在該區(qū)段的下游存在兩個(gè)甘氨酸(G194及G198),通過同源模建模擬了三個(gè)突變體(G194P,G194P／G198P及G198P)的三維結(jié)構(gòu),再利用分子動力學(xué)模擬來驗(yàn)證這些突變的效果,發(fā)現(xiàn)只有突變G194P能明

4、顯提高區(qū)段186—193的構(gòu)象穩(wěn)定性。將野生型與三個(gè)突變體的基因進(jìn)行表達(dá)、蛋白質(zhì)純化并測定各自的熱穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算結(jié)果基本一致,G194P的Tm值與750分別比野生型提高了3.3℃與4.6℃。熱動力學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)G194P的焓變和野生型相當(dāng),但其熵變比野生型更低,這表明其受熱處理時(shí)構(gòu)象更加穩(wěn)定。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該策略是有效的針對蛋白質(zhì)進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造的分子設(shè)計(jì)方法。
　　 策略二為通過計(jì)算突變體和野生型蛋白質(zhì)解折疊自由能的

5、差值(△△G)和其正負(fù)類別來篩選可能會影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的位點(diǎn)。在本研究中我們設(shè)計(jì)了新的一個(gè)基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性影響的具體數(shù)值(即:△△G值)和其正負(fù)類別的軟件Prethermut。該軟件有兩個(gè)主要的特征,其一為它可以預(yù)測單點(diǎn)與多點(diǎn)突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響；其二為首次在特征設(shè)計(jì)的過程中引入了一個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)特征,將突變體的結(jié)構(gòu)特征和這個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)特征進(jìn)行比較,而不是直接將突變體的結(jié)構(gòu)特征和野生型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行比

6、較。用數(shù)據(jù)集S-dataset來測試該軟件的性能,并將其與一些常用的類似軟件進(jìn)行比較,結(jié)果表明該軟件無論是分類預(yù)測的能力還是回歸預(yù)測的能力均優(yōu)于已有的常用軟件。
　　 我們同樣將該策略應(yīng)用于MPH-Ochr來提高該酶的熱穩(wěn)定性并檢驗(yàn)該策略的有效性。利用蛋白質(zhì)的位點(diǎn)進(jìn)化熵(E),Prethermut的分類預(yù)測結(jié)果以及回歸預(yù)測結(jié)果,篩選到可能不影響該酶的功能但可能會改善其熱穩(wěn)定性的7個(gè)氨基酸位點(diǎn)。在這7個(gè)位點(diǎn)構(gòu)建定點(diǎn)飽和突變體庫,從

7、中篩選出陽性克隆,再評估突變對蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明有6個(gè)突變體庫均可以篩選得到熱穩(wěn)定性較野生酶提高的突變體。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用該策略篩選影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性位點(diǎn)的方法是行之有效的。
　　 根據(jù)篩選到的6個(gè)突變體庫中的單點(diǎn)突變信息,進(jìn)行多點(diǎn)組合突變。組合突變的策略為先將篩選突變體文庫獲得的6個(gè)突變體按照熱穩(wěn)定性提高程度進(jìn)行排序,然后在最優(yōu)的單點(diǎn)突變體的基礎(chǔ)上進(jìn)行雙點(diǎn)突變(突變位點(diǎn)為熱穩(wěn)定性第二優(yōu)的突變位點(diǎn)),然后在最優(yōu)的