棉花葉肉原生質(zhì)體分離及目標基因瞬時表達體系建立和一個含DUF761DOMAIN的基因功能分析.pdf

1、1.棉花是世界性重要的經(jīng)濟作物。隨著棉花基因組序列信息釋放，大量棉花重要基因的功能特征需進一步鑒定。目前，二倍體雷蒙德氏棉種基因組序列已釋放，利用已測序基因組序列信息，建立基于棉花原生質(zhì)體的基因瞬時表達體系，將加速棉花功能基因組學研究進程。本研究以棉花幼嫩子葉為材料，分析影響棉花葉肉原生質(zhì)體分離及目標基因轉(zhuǎn)化的主要因素，以棉花葉肉原生質(zhì)體為受體，建立了穩(wěn)定、高效的目標基因瞬時表達與鑒定體系。主要研究結(jié)果如下:
　　1).棉花葉肉原

2、生質(zhì)體的分離。以葉肉原生質(zhì)體為受體，從葉齡、滲透壓濃度以及葉片的酶解時間三個方面優(yōu)化葉肉原生質(zhì)體提取，建立酶解法提取棉花原生質(zhì)體的體系。該技術(shù)體系主要包括，選擇自然生長12d的棉花幼嫩子葉為外植體材料，將1.5％纖維素酶、0.4％離析酶、0.5 mol/L甘露醇、20 mmol/L1 KCl、20 mmol/L MES、0.1 mol/L CaCl2和1.0 g/L BSA等溶液混合配成酶解液，在26℃、黑暗條件下，振蕩酶解8h，可從子

3、葉葉片中游離出純凈棉花葉肉原生質(zhì)體。濃度達到1.0×106 g/ml以上，原生質(zhì)體活性達90％以上。
　　2).基于棉花原生質(zhì)體的基因的瞬時轉(zhuǎn)化體系建立:選擇棉花鋅指蛋白基因GhZFP2為基因供體，將GhZFP2整合到pJIT166-GFP質(zhì)粒載體，構(gòu)建了GhZFP2∶GFP融合載體。采用40％ PEG(4000)介導轉(zhuǎn)化，將ZFP2-GFP和GFP載體分別轉(zhuǎn)化到原生質(zhì)體中，獲得高轉(zhuǎn)化率的棉花葉肉原生質(zhì)體。對目標基因瞬時表達產(chǎn)物檢

4、測表明，GhZFP2蛋白清晰定位在細胞核上。
　　2.棉纖維是最長的單細胞，其纖維發(fā)育與擬南芥毛發(fā)育有一定共性。前期本實驗室從陸地棉纖維發(fā)育文庫中克隆出一個含DUF761 DOMAIN的功能未知基因，該基因編碼330個氨基酸，在四倍體陸地棉中含2個拷貝，A、D亞組各一個。其中At亞組拷貝理論等電點(PI)為7.77，分子量(MW)37.60KDa。Dt亞組拷貝理論等電點(PI)為6.29，分子量(MW)37.63KDa。其在根、莖

5、，及不同纖維發(fā)育期表達量較高。為了進一步闡明其功能角色，我們進行了亞細胞定位及轉(zhuǎn)基因功能初步分析研究。子葉原生質(zhì)體亞細胞定位顯示，該基因A、D亞組兩個拷貝均定位于葉綠體上。利用農(nóng)桿菌介導法將DUF761At(Dt)基因過表達載體分別轉(zhuǎn)入擬南芥中，外源專化基因PCR分析鑒定，分別獲得轉(zhuǎn)DUF761At轉(zhuǎn)基因純系8個，轉(zhuǎn)DUF761Dt轉(zhuǎn)基因純系10個。RT-PCR分析顯示，A4，A7，A8，D1，D2，D46個轉(zhuǎn)基因品系其表達水平顯著高于

6、野生型對照。表型分析表明，與WT相比，分別轉(zhuǎn)DUF761At(Dt)兩套基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥材料顯示明顯不同表型，其中在無阻力作用下，轉(zhuǎn)DUF761At主根長不變，側(cè)根分支數(shù)明顯多于野生型;轉(zhuǎn)DUF761Dt無主根，根分支數(shù)增加，根長明顯變短。而在有阻力作用下，轉(zhuǎn)DUF761At的轉(zhuǎn)基因材料根盤旋在培養(yǎng)基上方，無法深入到固體培養(yǎng)基內(nèi)部，而轉(zhuǎn)DUF761Dt的轉(zhuǎn)基因材料其根長明顯變短，但可進入固體培養(yǎng)基內(nèi)部。說明這兩個部分同源基因在控制根毛